本发明专利技术提供了一种促进切割取样性别鉴定胚胎冷冻解冻后体外发育的方法，其特征在于，其是将切割取细胞样进行性别鉴定后的胚胎冷冻解冻后在含褪黑素的培养液中进行体外培养，提高了胚胎切割取样冷冻后体外发育的孵化率，减轻了切割及冷冻对胚胎的损伤，可以增加胚胎移植后的附植潜力，从而增加性别鉴定后胚胎的利用效率。此外，本发明专利技术方法中的MT是直接用培养液(如CR1aa液)溶解的，不使用常规的DMSO和乙醇溶解，避免了DMSO和乙醇可能对胚胎造成的毒害作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及。
技术介绍
1904年，Spemann将蛙的胚胎进行分割，获得了同胚双生后代，之后研究者分别对小鼠、兔子、羊等动物的不同时期的胚胎进行了分割后培养及移植的实验，至1988年，由张涌教授完成的我国第一个胚胎分割二分胚小鼠在西北农业大学诞生，目前已有猪、马、牛、 羊、兔、小鼠、人分割胚后代。随着胚胎生物技术的发展，胚胎分割及胚胎的性别鉴定技术已成为不可缺少的组成部分。胚胎性别鉴定技术推动了胚胎移植的产业化发展，加速了特别是乳畜品种的改良，对现代畜牧业的发展起到了积极的作用。性别鉴定后胚胎的质量由于取样等操作过程的影响而有明显降低，尤其在胚胎冷冻后，其发育潜能会受到较大影响。如何克服这一现象已经成为目前生殖生物学领域研究的热点问题之一。胚胎冷冻尤其是切割取样后胚胎的冷冻，胚胎的透明带、细胞骨架、线粒体的损伤及胚胎数量的减少，使得解冻后极易受到外界环境的氧化应激，降低胚胎的质量，导致胚胎移植的妊娠率大大降低。研究表明，冷冻对胚胎细胞膜的损伤是由自由基引起的。褪黑素(melatonin，MT)是松果体的主要分泌物，具有良好的水溶性和脂溶性，它可以通过各种膜结构进入细胞器有效地清除细胞代谢中产生的自由基和R0S，另外，MT还可以刺激抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶等的活性，从而有效的降低切割和冷冻使胚胎受到的氧化应激。目前的研究已经证明，褪黑素可以促进羊、猪、牛和小鼠的胚胎的体外发育。冷冻的羊桑椹胚解冻后，在含有ι μ g/ml褪黑素的培养液中培养24h后，可以获得较高的孵化囊胚率，而且达到孵化末期，胚胎的退化率也较低。KT9M的褪黑素可以提高猪孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚细胞数，且对胚胎的热应激起到一定的保护作用。对牛体外受精胚胎的体外培养研究表明，在20%氧浓度时，褪黑素可以促进胚胎的体外发育， 而不是在7%时，这表明褪黑素有清除氧自由基的能力。Ishizuka等发现，10_4 10_6M的褪黑素可以提高小鼠的体外受精率，ΙΟ6 10_8M的褪黑素支持小鼠早期胚胎的体外发育。目前有关性别鉴定切割取样后冷冻胚胎的研究主要集中在如何减轻胚胎取样过程和冷冻过程所造成的损伤以及切割后冷冻前短时培养时间的长短上，还没有如何在解冻后复苏培养过程中提高复苏率的研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种促进性别鉴定切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法，其是将切割取细胞样后的胚胎冷冻解冻进行性别鉴定后在含褪黑素的培养液中进行体外培养；其中，所述培养液为CRlaa液，培养液中褪黑素的浓度为10_9 10_3mOl/ L，优选为 10_7 10_3mol/L，更优选为 10_3mol/L。其中，性别鉴定的步骤为以切取的胚胎细胞样品为模板，利用巢式PCR反应进行扩增，电泳检测PCR扩增产物，根据样品扩增结果来鉴定胚胎的性别。优选地，PCR扩增使用的引物为引物 1:5' -TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3‘，5' -TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3‘，引物 2 5 ‘ -TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3 ‘，5' -GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3‘。PCR反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共进行30个循环；最后在72°C延伸5min。前述的方法，培养时间为2.5 池。前述的方法，所述胚胎细胞来源于牛胚胎。优选来源于切割取样后的牛囊胚。本专利技术的优点在于(1)本专利技术方法能够提高胚胎切割取样冷冻后体外发育的能力，减轻了切割及冷冻对胚胎的损伤，大大提高了胚胎的利用效率。另外胚胎的孵化率增加，可以增加胚胎移植后的附植率，从而增加性别鉴定后胚胎的利用效率，增加经济及社会效益。(2)本专利技术方法中的褪黑素(MT)能够提高切割取样后冷冻的牛体内生产胚胎解冻后复苏能力，从而为提高鉴定胚胎的后续发育潜能和移植的妊娠率提供一定的理论基石出。(3)本专利技术方法中的MT是直接用培养液(如CRlaa液)溶解的，不使用常规的 DMSO和乙醇溶解，避免了 DMSO和乙醇可能对胚胎造成的毒害作用。附图说明图1为本专利技术较佳实施例胚胎冷冻管示意图。 具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。实施例1、胚胎的生产14 17月龄荷斯坦育成牛，生殖系统正常，无繁殖疾病，体况较好，膘情中等。经同期发情、超数排卵后进行人工授精，第7天采用非手术法冲胚。根据供体牛子宫颈的情况选择冲胚管，用60mL注射器直接与冲胚管相连进行冲胚，每头供体每侧子宫角使用220mL PBS冲卵液。将回收液用胚胎过滤器过滤，将剩下的30mL回收液倒于Φ 90mm培养皿中进行镜检。2、胚胎性别鉴定本专利技术采用PCR方法对奶牛胚胎进行性别鉴定，具体方法如下①校正显微操作仪上的切割刀。②将在CRlaa液中洗过的胚胎在切割液中反复进行吹吸3 5次，然后放在切割培养皿上的切割液滴中，使胚胎粘在培养皿的底部。③把培养皿放在显微操作仪的操作台上，在目镜下找到胚胎并置于视野中央，放下切割刀进行切割；对于桑椹胚切割卵裂球，对于囊胚切割滋养层细胞，切下来的样品为 5个细胞左右；用已吸有回收液的取样吸头吸取样品并放入盛有8 μ L超纯水的200 μ L Eppendorf管中，然后把Eppendorf管浸入液氮中，切好的胚胎用回收液回收到盛有CRlaa 液并编号的六孔培养板中，准备冷冻或移植。④对所切取的少量胚胎细胞O 4个)样品利用巢式PCR反应进行扩增，电泳检测PCR扩增产物，根据样品扩增结果来鉴定胚胎的性别，只有一条带的为雌性，两条带的为雄性。引物 1 5 ‘ -TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3 ‘5 ‘ -TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3‘引物 2 5 ‘ -TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3 ‘5 ‘ -GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3‘PCR扩增的反应体系总体积为20 μ L，其中10XPCR缓冲液2 μ L，4d NTP的浓度均为 200pmol/L，引物浓度为 5 20pmol/L，iTaq 酶 2. 5U，模板 DNAlO IOOng/μ L。PCR 循环参数为94°C预变性5min ；94°C变性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共进行30个循环； 最后在72°C延伸5min。PCR反应后，取5yL PCR扩增产物加入1 μ L上样缓冲液，在2%的琼脂糖凝胶上电泳。3、胚胎的冷冻已经鉴别出性别的胚胎，雌性胚胎用于牛场的胚胎移植，不进行鲜胚移植的雌性胚胎要进行冷冻保存，雄性胚胎冷冻后用来进行实验室研究。实验所用的抗冻冷冻液为 AG(美国GIBCO公司)，采用程序冷冻法，具体如下①将冷冻仪(澳大利亚Cryologic公司，型号CL-5500)组装接入电源，倒好液氮，并检查RUN键是否归位，选择冷冻仪的0程序进行冷冻-6°C植冰，降温速度为0. 5°C / min，-;35°C投入液氮。②装管，本试验采用五段装管方法，先装入两段AG冷冻液，然后第三本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种促进切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法，其特征在于，其是将切割取细胞样进行性别鉴定后的胚胎冷冻解冻后在含褪黑素的培养液中进行体外培养；其中，所述培养液为ＣＲ１ａａ液，培养液中褪黑素的浓度为１０－９～１０－３ｍｏｌ／Ｌ。
【技术特征摘要】
1.一种促进切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法，其特征在于，其是将切割取细胞样进行性别鉴定后的胚胎冷冻解冻后在含褪黑素的培养液中进行体外培养；其中，所述培养液为CRlaa液，培养液中褪黑素的浓度为10_9 10_3mol/L。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养液中褪黑素的浓度为10_7 10_3mol/L03.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养液中褪黑素的浓度为10_3mol/L。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，性别鉴定的步骤为以切取的胚胎细胞样品为模板，利用巢式PCR反应进行扩增，电泳检测PCR扩增产物，根据样品扩增结果来鉴定胚胎的性别。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增使用的引物为 引物 1 5 ‘ -TG...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘国世，李树静，田秀芝，高超，张洪海，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
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