本发明专利技术涉及一种抗菌肽的制备方法及其应用。目的是提供一种步骤简捷、表达效率高而又保持其体外抗肿瘤活性的抗菌肽Alloferon-1的制备方法以及rAlloferon-1-K的应用。技术方案是：串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法，包含以下步骤：1）设计一对末端单链DNA；2）PCR体系中生成串联体；3）电泳筛选14拷贝Alloferon-1串联体；4）构建原核重组表达系统E.coliBL21DE3pET42a-14×Alloferon-1-K；5）重组蛋白14rAlloferon-1-K表达提纯；6）胰蛋白酶酶切14rAlloferon-1-K，提纯获得rAlloferon-1-K。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肽的串联原核表达方法的建立、重组串联肽的酶切、纯化及应用，具体是抗菌肽Alloferon-I的串联原核表达方法，用胰蛋白酶酶切得到重组肽单体 rAlloferon-l-Kjf rAlIoferon-I-K 进行抗肿肿瘤活性检测。
技术介绍
抗菌肽是广泛存在于多种生物体内的无抗原性短肽，对各种微生物和原虫均有广谱高效的抑制或杀灭活性，一些抗菌肽还有抗肿瘤作用且不损伤正常细胞。因此，抗菌肽是目前抗感染及抗肿瘤新药的研究热点。Alloferon-I首先在红头丽蝇血液中发现，是由13个氨基酸组成的、分子量为 1481. 53的新型抗菌肽。但其较低的天然表达产量难以满足产业化要求。有文献报道，采用高效的原核表达可便利地获得大量Magainin-II等抗菌肽，并证实其生物学活性与天然产物相似。因此，研究Alloferon-1重组串联高效表达技术上可行。动物实验证实该抗菌肽Alloferon-I有较强的抗肿瘤、抗病毒活性，因此，研究Alloferon-I重组串联高效表达产物的抗肿瘤应用研究有现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种步骤简捷、表达效率高而又保持其体外抗肿瘤活性的抗菌肽Alloferon-I制备方法。本专利技术的另一目的是上述表达产物rAlIoferon-I-K的应用。本专利技术提供的技术方案是串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法，具体包含以下步骤1)设计一对非镜像对称含互补粘性末端单链DNA；正链序列5’_磷酸化-CATGGCGTGA GCGGCCATGGCCAGCATGGCGTGCATGGCAAA-3，，负链序列5，-磷酸化-GCCATGGCCGCTCACGCCATG TTTGCCATGCACGCCATGCTG-3 ‘；2)在PCR反应体系中，通过退火，获得单拷贝双链DNA，利用互补粘性末端在PCR体系中随机串联，生成不同拷贝的串联体；3)T-A克隆产物琼脂糖电泳筛选14拷贝Alloferon-Ι串联体，测序鉴定；4)用测序鉴定正确的T-A克隆14拷贝Alloferon-1串联体构建原核重组表达系统Ε. C0liBL21DE3pET42a-14XA11°ferrari-K;5)IPTG诱导目的重组蛋白HrAlloferon-I-K表达，Ni-NTA亲和层析提纯并收集目的重组蛋白；6)胰蛋白酶酶切14rAlloferon-l-K，SephadexG-50层析法提纯获得 rAlloferon-1-K，浓缩后检测 rAlloferon-1-K 浓度。所述的抗菌肽Alloferon-1的串联原核表达14拷贝Alloferon-1后的重组蛋白rAlloferon-1-K，具有序列表3所示的核苷酸序列和氨基酸序列。串联抗菌肽Alloferon-I的制备方法获得的重组蛋白rAlIoferon-I-K应用于抗肿瘤。本专利技术的有益效果是经肿瘤体外抗肿试验显示，本专利技术提供的制备方法获得的重组蛋白rAlloferon-1-K，具有明显抑制KB、SGC和HL-60细胞生长及增殖的效果。上述研究结果表明，我们成功建立了抗菌肽Alloferon-1串联原核制备方法，其制备产物 rAlloferon-1-K可望成为多肽类抗肿瘤新药。此外，本专利技术采用酶切效率更高的胰蛋白酶代替肠激酶酶切可降低制备成本，有利于推广应用。具体实施例方式序列表说明序列表1是红头丽蝇血液中发现的的一种新型抗菌肽Alloferon-1的氨基酸序列。序列表2是抗菌肽AlIoferon-I的氨基酸序列及人工合成的对应核苷酸序列(带胰蛋白酶切位点赖氨酸)，上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列。序列表3是rAlloferon-1-K串联序列；14拷贝的rAlloferon-l-K串联序列，每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，有方框区为14拷贝的Alloferon-Ι序列，口内氨基酸与核苷酸序列为胰蛋白酶酶切位点赖氨酸及其密码。)据文献报道，Alloferon-1氨基酸序列为HGVSGHGQHGVHG有抗病毒、抗肿瘤活性， Alloferon-2的氨基酸序列则为GVSGHGQHGVHG无活性的，两者序列差异仅体现在N端，故 N端极可能是Alloferon-1活性关键部位所在。我们通过Alloferon-1的C端加胰蛋白酶酶切位点赖氨酸密码子串联表达不易影响其生物学活性，串联表达产物通过胰蛋白酶酶切K位点可获得多个单一 rAlloferon-l-K (HGVSGHGQHGVHGDDDDK)，提高产量的同时可保持 Alloferon-1的活性。为了获得更高的目的重组表达产量，我们构建并筛选获得含14个重复串联式表达 HrAlloferon-l-K 的原核重组表达系统 E. coli BL21DE3pET42a-14XAlloferon-1-K, 采用Ni-NTA和kphadex G_50层析法，快速提纯目的串联表达产物。T-A克隆后测序结果表明，我们克隆的Alloferon-1-Κ序列完全正确。采用连接引物PCR和T-A克隆技术，我们获得了与预期序列相同的人工融合基因片段及其克隆。构建的原核重组表达系统pET4^i-14Alloferon-l-K-E. coliBLDE3 在 IPTG 诱导下，可高效地表达串联式目的重组蛋白HrAlloferon-l-K，其产量约为细菌总蛋白的 30%，经Ni-NTA柱提纯后在聚丙烯酰胺凝胶中呈现为单一的蛋白条带。HrAlloferon-I-K 经胰蛋白酶酶切后，用kphadex G-50柱提纯rAlloferon-1-K，这为进一步研究 rAl loferon-l-K体内外抗肿瘤、抗病毒等活性提供了良好的基础。用直接化学合成的Alloferon-1 (cAlIoferon-Ι)及含有胰蛋白酶酶切位点的 Alloferon-1 (cAlloferon-1-K)作为对照检测了 rAlloferon-1-K 体外抑制 KB、SGC 和 HL-60肿瘤细胞生长及增殖的效果。结果显示rAlloferon-1-K有明显抑制KB、SGC和HL-60 细胞生长及增殖的效果，且与cAlloferon-Ι和cAlloferon-1-K抑制作用无明显差异。实施例串联抗菌肽Al loferon-1的制备方法是1)从GenBank获得红头丽蝇天然AlIoferon-I的氨基酸序列N_HisGly Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly-C(Alloferon-1 序列不含精氨酸和赖氨酸)；2)设计一对非镜像对称含互补粘性末端单链DNA；根据报道的Alloferon-1氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子，同时考虑串联表达的Alloferon-1分离，正链序列5’ -磷酸化 -CATGGCGTGAGCGGCCATGGCCAGCATGGCGTGCATGGCAAA-3，，在正链 DNAAlloferon-I 基因 3，端设胰蛋白酶酶切位点赖氨酸密码子，负链序列5’ -磷酸化-GCCATGGCCGCTCACGCCATGTTTGC CATGCACGCCATGCTG-3’。负链DNA与正链交错互补；委托hvitrogen公司合成。3)目的肽核苷酸序列双链的形成；在1XT4DNA连接酶缓冲液(T本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．串联抗菌肽Ａｌｌｏｆｅｒｏｎ－１的制备方法，具体包含以下步骤：１）设计一对非镜像对称含互补粘性末端单链ＤＮＡ；正链序列：５’－磷酸化－ＣＡＴＧＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡ－３’，负链序列：５’－磷酸化－ＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧ－３’；２）在ＰＣＲ反应体系中，通过退火，获得单拷贝双链ＤＮＡ，利用互补粘性末端在ＰＣＲ体系中随机串联，生成不同拷贝的串联体；３）Ｔ－Ａ克隆产物琼脂糖电泳筛选１４拷贝Ａｌｌｏｆｅｒｏｎ－１串联体，测序鉴定；４）用测序鉴定正确的Ｔ－Ａ克隆１４拷贝Ａｌｌｏｆｅｒｏｎ－１串联体构建原核重组表达系统Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ＤＥ３ｐＥＴ４２ａ－１４×Ａｌｌｏｆｅｒｏｎ－１－Ｋ；５）ＩＰＴＧ诱导目的重组蛋白１４ｒＡｌｌｏｆｅｒｏｎ－１－Ｋ表达，Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析提纯并收集目的重组蛋白；６）胰蛋白酶酶切１４ｒＡｌｌｏｆｅｒｏｎ－１－Ｋ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０ 层析法提纯获得 ｒＡｌｌｏｆｅｒｏｎ －１－Ｋ，浓缩后检测ｒＡｌｌｏｆｅｒｏｎ－１－Ｋ浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙琦，孙爱华，严杰，
申请(专利权)人：严杰，
类型：发明
国别省市：86
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