采用高温冷冻法低温保藏生物活性物质制造技术

通过制备要冷冻的可存活的生物材料、将其浸入装有冷却液的容器中、并以基本上恒定的预定速率和温度使冷却液环流通过该生物材料，使其冷冻，从而将存活的生物材料进行低温保藏（低温保存）。本发明专利技术的方法以足够快的速率冷冻生物材料，以避免在细胞结构内形成冰晶（玻璃化）。冷却液的温度较佳为－２０℃到－３０℃，这个温度范围足够使细胞膜中由于热变化而导致的应力破坏的形成减少到最小程度。采用本发明专利技术方法冷冻的细胞具有约８０％的存活率，此比率明显高于其它的低温保藏方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

Cryopreservation of bioactive substances by high temperature freezing

By preparing to freeze the viable biological material, will be immersed in containers with cooling fluid, and basically a constant predetermined rate and the temperature of the cooling fluid circulation through the biological material, which can be frozen, viable biological material is low temperature preservation (low temperature preservation). The method of the invention is to freeze the biological material at a fast enough speed to avoid the formation of ice crystals (vitrification) in the cell structure. The temperature of the coolant is preferably - 20 - to - 30 DEG C, which is sufficient to minimize the formation of stress failure due to thermal changes in the cell membrane. The cells frozen by the method of the invention have a survival rate of about 80%, which is obviously higher than other low temperature preservation methods. \ue5cf

【技术实现步骤摘要】
本专利技术总的涉及低温保藏，更具体地说，本专利技术涉及采用玻璃化技术低温保藏生物活性物质。
技术介绍
低温保藏(低温保存)可以定义为为了保藏和再次恢复到其冷冻前活着的状态，将活的结构和生化分子的温度降低到冷冻点以下。18世纪进行的犬精液试验首次证明，单细胞可被冷冻，并在之后解冻，有小百分比的细胞恢复了正常的生理功能。后来，在20世纪，人们发现如果在化学制备这些细胞时，在冷冻过程中使用总称为低温防冻剂的化合物使这些细胞能经受得住，则细胞的恢复率提高。但是，即使使用低温防护剂，由低温保藏状态恢复到正常状态的恢复率也常常为50％或以下。迄今为止，提高低温保藏的恢复率的尝试一般都集中于冷冻前处理生物材料的新低温防冻剂和非常慢或快的冷冻技术。这两种技术一般都是针对减少冷冻过程中冰晶的形成所致的细胞内水膨胀而导致的细胞损伤。理论上，非常慢或快的冷冻将减少或消除细胞内冰晶的形成。非常慢速率的冷冻的机制包括从氮蒸气到液氮的受控下降，或者使样品先通过非常冷的醇化合物，继而投入液氮中。在冷冻过程中，这种方式的冷冻不使冰晶尺寸进一步生长，但仍有冰晶形成。另一种技术，常称为玻璃化作用，是直接将样品投入液氮中，试图将细胞内的水快速冷冻，从而抑制冰晶的形成。玻璃化作用将细胞的温度快速地从室温降到液氮的温度-196℃。在如此短的时间内，温度的这种极大落差常常导致细胞膜内的应力破坏。低温防冻剂与玻璃化作用和其它各种冷冻技术一道使用。专利技术概要因此，需要一种改进的方法来低温保藏能生存的单细胞、组织、器官、核酸或其它生物活性分子，该方法至少能避免目前采用的方法中所固有的一些问题。因此，本专利技术的至少一个实施例提供一种低温保藏的方法，该方法包括将生物活性材料浸入冷却液中，并使该冷却液环流通过该材料。材料在浸入之前可先进行化学处理，也可不进行化学处理，取决于所要低温保藏的材料类型。冷却液以基本上恒定的预定速率和温度环流通过材料，将其冷冻，这样材料被玻璃化，并且减少细胞膜中形成的应力破坏。在至少一个实施例中，冷却液被维持在约-20℃到-30℃之间的温度，冷却液流过材料的速率大约为35升/分钟/英尺冷冻液体，该冷却液通过不大于约24英寸(宽)×48英寸(深)的面积。此外，本专利技术至少一个实施例直接将材料冷冻到约-30℃以下。本专利技术又一实施例提供一种已进行这种低温保藏处理的生物材料。本专利技术至少一个实施例的目的是以避免形成冰晶和应力破坏的方式冷冻生物材料。本专利技术至少一个实施例的一个优点是低温保藏恢复率明显增加，因为生物材料在冷冻期间被玻璃化。本专利技术至少一个实施例的另一优点是低温保藏恢复率提高，因为生物材料在足够高的温度下玻璃化，避免了细胞膜内形成应力破坏。本专利技术至少一个实施例的另一优点是一旦被冷冻，目前的低温保藏设备和机制可用于保存该冷冻的生物材料。附图的简要说明在结合附图考虑以下描述和权利要求之后，将能理解本专利技术的其它目的、优点、特征和特性，和相关结构要素的方法、操作和功能，以及制造零件和经济学的组合，所有这些都是本说明书的一部分，其中，相同的参考数值在各图中表示相应的部件附图说明图1是适用于实施本专利技术至少一个实施例的方法的冷却装置的侧视图。图2是图1中的冷却装置的横截面的侧视图。图3是阐述本专利技术至少一个实施例的方法的流程图。图4是显示采用各种常规的冷冻器(并不是所有的冷冻器都用于低温保藏和储存)和本专利技术优选实施例的冷冻方法对全无核葡萄的横截面进行无化学制剂冷冻所得的细胞损伤的试验比较结果的柱形图。图5是显示现有的冷冻方法和本专利技术优选实施例的冷冻方法在将人的精子解冻后细胞存活和功能的试验比较结果的柱形图。图6是显示现有的冷冻方法和本专利技术优选实施例的冷冻方法在将猪的肌肉细胞解冻后细胞存活和功能的试验比较结果的柱形图。图7是显示现有的冷冻方法和本专利技术优选实施例的冷冻方法在将小鼠胚胎解冻后细胞存活和功能的试验比较结果的柱形图。本专利技术优选实施例的详细描述首先结合图1和2讨论适用于实施本专利技术至少一个实施例的一种冷却装置，通常将其称为冷却系统100。冷却系统100较佳包括装有冷却液140的容器110。浸没在冷却液140中的是循环器134，如具有推进器132的马达130、热交换线圈120和支架150，该支架150在一个实施例中包括用于支持生物材料冷冻的托盘155。生物材料可包括但不限于能存活的单细胞、组织和器官、核酸和其它生物活性分子。在容器110之外与热交换线圈120相连的是致冷器190。容器110可以是将要冷冻的生物材料浸入冷却液140中所需的任何尺寸，该冷却液的体积为12英寸×24英寸×48英寸。根据本文所述的内容，也可以使用其它尺寸的容器。例如，在一个实施例中(未阐述)，容器110的大小为刚好容纳足够的冷却液140，这样，诸如小瓶、试管、烧杯、量筒等之类的容器就可以放在容器110中，用于快速冷冻含有生物材料和低温防冻剂的悬浮液。在其它实施例中，容器110大到足以将整个器官或有生物体完整地浸入，以进行快速冷冻。将可理解，容器110可制成较大的，或者制成较小的，这要根据有效适应要冷冻的生物材料的各种尺寸和数量的需要而定。容器1 10中装有冷却液140。在一个实施例中，该冷却液是食物级溶质。食物级质量液体的好例子是基于丙二醇、氯化钠等的那些液体。在另一实施例中，冷却液本身就是低温防冻剂，如二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等。注意到在一些例子中，低温防冻剂本身就是好的食物级质量液体。在其它实施例中，用其它液体作为冷却液，优选溶质。虽然可使用各种容器来装生物材料，但是本专利技术的一些实施例直接将生物材料浸入冷却液中进行快速和有效的冷冻。这种直接浸入的方法可简化一些组织和器官的低温保藏。为了在冷冻生物材料的同时避免冰晶的形成，本专利技术的一个实施例以不超过24英寸宽×48英寸深的面积中含有的每英尺冷却液每分钟35升的相对恒定速率将冷却液140环流通过要冷冻的生物材料。必需的环流由一个或多个循环器134(如马达130)提供。在本专利技术的至少一个实施例中，浸没的马达130驱动推进器132，将冷却液140环流通过要冷冻的生物材料。也可使用与本专利技术目的一致的其它的循环器134，包括各种泵(未阐述)。在本专利技术的至少一个例子中，使用除了马达130以外的至少一个循环器134来增加环流的冷却液的面积和体积。在使用多个循环器134的实施例中，冷却液环流的面积和体积与所使用的各个附加的循环器成正比。例如，在一个优选的实施例中，使用一个附加的循环器来推进各英尺要环流的冷却液通过不超过约24英寸宽×48英寸深的面积。较佳的是，可控制马达130，以维持冷却液以恒定的预定速率流过要保藏的生物材料，而同时维持容器110内所有的点上的冷却液温度平均分布在+/-0.5℃之内。冷却液以基本上恒定的预定速率环流过生物材料，这样可恒定地、准确地移走热量，从而使生物材料在冷冻期间玻璃化。在一个实施例中，测量和处理冷却液的特性如粘度、温度等，然后将控制信号传送给马达130，以根据需要增加或减少推进器的旋转速率或扭矩。在其它实施例中，将马达130设为在一定范围的液体条件中维持在给定的旋转速率。在这个例子中，由马达130赋予的推进器132的扭矩或旋转速率不是由外部控制的。要注意的是，不需要外部的泵、轴或滑轮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低温保藏法，它包括：将生物活性材料浸入冷却液中；和以基本上恒定的预定速率和温度使所述冷却液环流通过所述生物活性材料，以冷冻该生物活性材料，使其玻璃化，并将细胞膜中应力破坏的形成减少到最小程度。

【技术特征摘要】
US 2000-6-12 60/210,9131.一种低温保藏法，它包括将生物活性材料浸入冷却液中；和以基本上恒定的预定速率和温度使所述冷却液环流通过所述生物活性材料，以冷冻该生物活性材料，使其玻璃化，并将细胞膜中应力破坏的形成减少到最小程度。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷却液的温度维持在约-20℃到-30℃之间。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷却液流过所述生物活性材料的速率大约是每英尺的冷却液每分钟以约35升的量通过不大于约24英寸宽×48英寸深的面积。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以化学方法制备所述要冷冻的生物活性材料。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学方法制备要冷冻的生物活性材料包括用低温防冻剂处理所述材料。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷却液的环流由浸于其中的循环器驱动。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述循环器包括马达；和耦合于该马达随其旋转的推进器，推进器的旋转使冷却液环流。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述冷却液环流通过浸没在该冷却液中的热交换线圈中，所述热交换线圈至少能从所述冷却液中带走与该冷却液从所述生物活性材料中带走的热量相同的热量。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述热交换线圈是多通路线圈。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述热交换线圈的大小直接与冷却液环流通过的面积相关，其中，该面积约为24英寸宽×48英寸深。11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用基本上匹配热交换线圈的负荷需求的致冷器冷却该热交换线圈。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是可存活的单细胞。13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是可存活的组织。14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是可存活的器官。15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是有活力的核酸。16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是有活力的核糖核酸。17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是有活力的、基于氨基酸的化合物。18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性材料是有活力的、基于脂质的化合物。19.一种低温保藏的方法，该方法包括将生物活性材料浸入冷却液中；和以基本上恒定的预定速率和温度使所述冷却液环流通过所述生物活性材料，直接将其冷冻到约-30℃以上的温度，使其玻璃化。20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述冷却液的温度维持在约-20℃到-30℃之间。21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述冷却液流过所述生物活性材料的速率大约是每英尺的冷却液每分钟以约35升的量通过不大于约24英寸宽×48英寸深的面积。22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以化学方法制备所述要冷冻的生物活性材料。23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述化学方法制备要冷冻的生物活性材料包括用低温防冻剂处理所述生物活性材料。24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述冷却液的环流由浸于其中的循环器驱动。25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述循环器包括马达；和耦合于该马达随其旋转的推进器，推进器的旋转使冷却液环流。26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述冷却液环流通过浸没在该冷却液中的热交换线圈中，所述热...

【专利技术属性】
技术研发人员：SD普里恩，J布兰顿，KR庞德，MF米勒，B伍德，AJ卡斯尔，
申请(专利权)人：苏帕契勒国际控股有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]