一种牛支原体致弱菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛支原体致弱菌株及其应用，其步骤是A．分离鉴定牛支原体强毒株：通过病原分离培养、PCR检测，确定其病原为牛支原体。B．牛支原体弱毒株的培育：将分离到的牛支原体在体药物体培养基，于培养箱中培养，培养基从红色变成透亮的黄色。从上一代菌液取出1μl，接种PPLO培养基，培养。C．试验表明，该代次牛支原体已充分致弱。通过形态学检测，试验结果验证了由牛支原体MbovHB0801培育的150代传代菌株MbovHB0801-150.2。D．该牛支原体致弱株MbovHB0801-150.2，CCTCC?M2011102。具有良好的疫苗开发前景和广阔的临床应用价值，成本低、对动物体刺激性小，产生巨大的经济效益和社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物药物领域，具体涉及一株由牛支原体强毒株Mycoplasma bovis HB0801 (MbovHB0801)体外传代致弱的弱毒菌株MbovHB0801_150. 2，还涉及该致弱菌株在 制备预防和控制由牛支原体所致疾病中的用途。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasma bovis)主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎等。该病原于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到(Hale et al.，1962)。1976 年牛支原体被描述为致呼吸道疾病的主要病因(Gourlay R N et al.，1976)，此后不同国家都有暴发流行，给养牛业造成了严重的经济损失。欧洲每年约有25% 33%的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1. 44 1. 92亿欧元，其中英国每年就有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡数达15. 7万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1. 40亿美元，单个牛场最高感染率达70%。我国于2008年首次报道牛支原体肺炎的流行(石磊等，2008)，此后发现该病在我国肉牛养殖为事普遍发生，造成了严重的经济损失。虽然牛支原体自首次发现至今已有50年，但牛支原体所致疾病的防控手段仍处于初级阶段，疫苗研究尤其如此，目前还没有一种高效安全的疫苗用于牛支原体预防。但由于药物临床治疗效果差，疫苗研究一直受到重点关注。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株，该牛支原体弱毒株对牛的致病力明显减弱，但保持良好的免疫原性。与现有的牛支原体灭活疫苗相比，该菌株具有制备方法简单、成本相对低、对动物体刺激性小和免疫效果好等优点。本专利技术的另一个目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株在制备预防和控制牛支原体所致疾病生物制剂的药物中的应用。本专利技术的再一个目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150. 2在制备治疗或预防牛肺炎的生物制剂的药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施将从临床分离的牛支原体强毒株MbovHBOSOl在体外液体培养基中高温条件下 (410C )连续传至150代，得到牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150. 2。该牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150. 2的制备步骤是A.分离鉴定牛支原体强毒株2008年，湖北省从外地引进肉牛中，陆续报道发生呼吸道疾病，牛群引进后不久即发病，表现为发热、咳嗽、流鼻涕，犊牛和体质弱的架子牛发病严重，死亡率可高达40%甚至更高，病后期可见关节炎和腹泻症状。剖检时，病理变化主要集中在胸腔，以化脓性或干酪样坏死性肺炎为主。胸腔内有浆液样积液，肺与胸膜可发生粘连，肺组织发生肉变，并分布大小不等的白色坏死灶，关节积液等(石磊等，2008)。通过病原分离培养、PCR检测与测序分析、动物回归试验等方法，确定其病原为牛支原体，命名为 MbovHB0801oB.牛支原 体弱毒株MbovHB0801-150.2的培育将本专利技术分离到的牛支原体 (MbovHB0801株)在体外培养基中高温条件下(41°C )连续传至150代。具体操作是①.将牛支原体MbovHB0801接种含有酚红的PPLO液体培养基，于41°C培养箱中培养2-3天后，培养基从红色变成透亮的黄色。②.从上一代菌液取出1 μ L，接种新鲜PPLO培养基，于41°C恒温培养箱中培养 2-3天后，再传下一代，直到150代。C.动物试验表明，该代次牛支原体已充分致弱。通过形态学检测，纯粹性检测、特异性检测和外源细菌检测等试验结果验证了由牛支原体MbovHBOSOl培育的150代传代菌株MbOVHB0801-150. 2具有典型的牛支原体菌落特征，纯净无外源细菌污染。D.该牛支原体致弱株MbovHB0801-150. 2已提交认可的机构保藏，其保藏号是 CCTCC NO :M2011102 ；保藏时间2011年3月31日；保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国.武汉.武汉大学，分类命名牛支原体MbovHB0801-150. 2 Mycoplasma bovis MbovHB0801-150. 2。牛支原体致弱毒株MbovHB0801_150. 2的具体特征如下A.形态学特征形态特性符合细菌分类学中支原体的形态特性，是一种缺乏细胞壁、呈高度多形性、可通过滤菌器，并能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物；在固体培养基上形成特征性的“煎荷包蛋”样菌落。革兰氏染色阴性，不易着色，通常用吉姆萨染色呈淡紫色。B.培养特征本菌为兼性厌氧菌，在含0.8万单位/ml青霉素的PPLO培养基平板上，于37°C在含5% (ν/ν)的CO2的细胞培养箱中培养，2-3天后，用光学显微镜低倍观察菌落形态，具有“煎荷包蛋”样菌落典型特征(附图说明图1)。C.生化特性将MbovHB0801-150. 2菌液50μ 1加入到生化管中，置于37°C恒温培养箱中，根据生化管要求判断结果(如下表)。经与标准(参考兽医微生物学第三版，陆承平主编)比对，MbovHB0801-150. 2与牛支原体及无乳支原体生化反应最接近。权利要求1.一种牛支原体致弱株MbOVHB0801-150. 2，其特征在于牛支原体致弱株 (.Mycoplasma Bovis, Μ. bo ν is), CCTCC NO :M2011102。2.利要求1所述的一种牛支原体致弱菌株MbOVHB0801-150.2在制备预防和控制牛支原体感染生物制剂的药物中的应用。3.权利要求1所述的一种牛支原体致弱菌株MbOVHB0801-150.2在制备治疗或预防牛的肺炎制剂的药物中的应用。全文摘要本专利技术公开了一种牛支原体致弱菌株及其应用，其步骤是A．分离鉴定牛支原体强毒株通过病原分离培养、PCR检测，确定其病原为牛支原体。B．牛支原体弱毒株的培育将分离到的牛支原体在体药物体培养基，于培养箱中培养，培养基从红色变成透亮的黄色。从上一代菌液取出1μl，接种PPLO培养基，培养。C．试验表明，该代次牛支原体已充分致弱。通过形态学检测，试验结果验证了由牛支原体MbovHB0801培育的150代传代菌株MbovHB0801-150.2。D．该牛支原体致弱株MbovHB0801-150.2，CCTCC M2011102。具有良好的疫苗开发前景和广阔的临床应用价值，成本低、对动物体刺激性小，产生巨大的经济效益和社会效益。文档编号A61P11/00GK102220263SQ20111011709公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日专利技术者崔鹏, 巴晓亮, 张瑞, 彭清洁, 白智迪, 祁晶晶, 胡长敏, 郭爱珍, 陈焕春, 陈颖钰 申请人:华中农业大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种牛支原体致弱株ＭｂｏｖＨＢ０８０１－１５０．２，其特征在于：牛支原体致弱株（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｂｏｖｉｓ，Ｍ．　ｂｏｖｉｓ），ＣＣＴＣＣ　ＮＯ：Ｍ２０１１１０２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，白智迪，巴晓亮，胡长敏，陈颖钰，彭清洁，张瑞，祁晶晶，崔鹏，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83