朊病毒的消毒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于处理被ＰｒＰ↑［Ｓｃ］朊病毒蛋白或其替代物污染的表面、悬浮液或溶液的方法和组合物。该方法和组合物使用一种或多种有效地将朊病毒蛋白切割成具有非感染性分子量的片段的酶和一种或多种经选择以有利于ＰｒＰ↑［Ｓｃ］朊病毒蛋白构象解折叠而不使所述一种或多种酶变性的因子的组合。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及灭活朊病毒的组合物和方法，以及对被朊病毒或类似的构象改变的蛋白质污染的材料进行消毒的方法。
技术介绍
在历史上，感染病原如细菌、真菌、寄生虫和类病毒都有很好确立的控制方法，包括各种形式的消毒和灭菌(例如蒸汽灭菌法，干灭菌法，巴氏消毒法，过滤除菌法，利用环氧乙烷、戊二醛、苯酚或其它化学消毒试剂进行处理以及辐射等)。对于病毒，也有一些既定的方法，例如将pH值降低到4.0或更低、60℃下延长加热时间或使用高浓度的有机溶剂。此外，还使用过紫外线处理、甲醛和特效抗病毒剂。近年来，出现了以前未知的新的致病原物种，并在科学出版物上已有相关报道。人们将其称之为朊病毒，其代表了当今卫生保健业面临的最大挑战之一。朊病毒是一种感染性粒子，它不同于细菌和其它先前已知的感染病原。虽然没有可靠的证据确定朊病毒的确切结构，但是近来在人类和动物中已经确诊的许多疾病看起来都是由朊病毒引起的。如PCT/US00/14353(该文献的内容在此引作参考)中的详述，朊病毒导致的人类疾病包括库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、格施沙病(GSS)和致死性家族失眠症(FFI)。除了人类的朊病毒疾病外，已知的朊病毒疾病组中还包括动物的疾患。绵羊和山羊的痒病也许是研究最多的动物朊病毒疾病。一系列调查都已提示变种CJD与以前的流行病牛海绵状脑病(BSE)有关。但至今还没有发展出成功的治疗方法，因此这些疾病仍然是致命的。除上述问题以外，还有一个事实就是朊病毒在人体的潜伏期可长达30年，该因素向相关科学家提出一个巨大挑战，其中某些科学家预测一种流行病正“在途中”。可能处于感染危险的人群包括在手术中可能接触到受染医疗器械的病人、解剖受染物质的医护人员以及负责清洗和消毒器械的保健工作人员。令人关注的还有，有此危险的人群可能扩展到包括接触牛或牛肉的兽医、屠宰场的工作人员和肉商(主要在欧洲)，以及新近接受来自潜伏有朊病毒疾病的供体的输血或器官移植的人。朊病毒的结构已成为集中研究的主题，科学家们对该病毒的结构持有不同的观点。有些科学家认为它们是极小的病毒，然而大多数专家现在都认为朊病毒实际上是没有DNA或RNA核心的感染性蛋白质。更具体地，目前一致认为哺乳动物的PrP基因表达一种蛋白质，该蛋白质可以是可溶的、非疾病的细胞形式PrPc，或可以是不溶的疾病形式PrPSc。许多方面的证据表明，朊病毒疾病是由于正常的细胞形式转变成异常的PrPSc形式而导致的。在这两种形式的氨基酸序列中不存在可检测的差别。PrPc形式由可被蛋白酶K消化而降解的33-35kDa高度膜相关蛋白组成。然而PrPSc形式具有一种改变的构象形式，具体地说具有高水平的β-折叠构象。用于诊断具有感染性的改变的构象形式的PrPSc的特性就是其27-30kDa的耐蛋白酶核心。改变构象的感染性形式的另一显著特征就是它获得了一个疏水性核心。常规的消毒剂和灭菌剂在可接受的时间里对朊病毒都没有显著的影响。曾多次尝试灭活朊病毒和/或消毒可能染有该病毒的表面，但该病毒却表现出非凡的抵抗性。无论是在时间和费用上，还是在对材料的损坏和所涉及的职业健康危害方面，杀灭朊病毒所需的条件通常都过于严格而无法在常规的消毒中实施。例如在一项研究中，试样在600℃的温度下经5-15分钟干热后仍然检测到了感染性PrPSc粒子，尽管在1000℃的温度下15分钟内和高于200℃的温度下1-10小时内可以实现完全破坏。有人建议采用1M。苛性钠(pH值为14)处理2小时，但是这种处理腐蚀性极强、对工作人员有危险并侵蚀材料。US5633349公开了一种处理生物材料的方法，包括采用6-8摩尔尿素或1-2摩尔硫氰酸钠处理最少12小时(优选18小时)，但该方法同样具有类似的缺点。由于净化去污比较困难，所以有人提议优选用于脑外科手术的外科器械应该是一次性使用的，但这意味着除了费用昂贵以及对于有些器械来说不现实之外，处理这些器械也有一定危险。PCT/US00/14353描述了一种通过使用聚阳离子树状聚合物使朊病毒不具感染性的方法，但是该过程是可逆的还是永久性的以及对于表面消毒是否具有商业可行性都还不太清楚。尽管注意力已经集中在PrPc形式和PrPSc形式上，但还有人提出该蛋白质可能以一种中间形式存在，该中间形式的β-折叠含量介于PrPc形式α螺旋为主的结构和PrPSc形式β-折叠为主的构象之间，并能在缺乏变性剂的条件下保持其溶解性。认为正常情况下可溶的蛋白装配或误装配成构象改变的不溶蛋白可导致许多其它疾病或牵连其中。虽然本专利技术在此将涉及朊病毒进行描述，应理解其对于与疾病有关的其它不溶或耐酶的构象改变蛋白同样适用。对于现有技术的上述讨论不应理解为承认澳大利亚的公知常识。本专利技术的一个目的是提供对被朊病毒感染的表面进行消毒的改良的或至少是可供选择的方法。在某些优选的实施方案中，本专利技术更有效地使朊病毒失活，也就是说与现有技术的方法相比，本专利技术在给定时间内更有效，或者在更短的时间内同样有效。本专利技术某些高度优选的实施方案在低于60℃的温度下、少于60分钟的时间内实现优于4个对数级的降低。在一些实施方案中，本专利技术也适用于除表面以外其它情形下的朊病毒，例如在固体、液体、气体介质中的悬浮物或在生物体系中，本专利技术还可能有其它体外或体内用途。本专利技术中一些实施方案的目的是提供改进的诊断工具，另外一些实施方案则是为抗体的制备提供新的差向异构体。本文中所用的术语“朊病毒蛋白”包括变体、片段、融合体以及类似物，其具有与全长朊病毒蛋白序列基本上相同的其它相互作用或活性，但可能更便于使用，并包括所有形式的二级结构。本文使用的该术语还包括朊病毒替代物，即本身不是朊病毒但具有与朊病毒类似的结构或表现出类似行为的蛋白质，这些蛋白质可用作其模型或用于预测朊病毒在特定的条件下将如何表现。术语“PrPSc朊病毒蛋白”旨在具有类似广泛的含义，但仅局限于由于其二级或三级结构而耐酶的朊病毒蛋白，且它包括类似地耐酶的构象。本专利技术的描述第一方面，本专利技术提供一种方法，包括采用包含(1)和(2)的组合的制剂对被PrPSc朊病毒蛋白污染的表面进行处理的步骤，其中(1)为一种或多种可有效将朊病毒蛋白切割成具有非感染性分子量的片段的酶；(2)为一种或多种经选择以利于PrPSc朊病毒蛋白构象解折叠同时不使上述一种或多种酶变性的因子。第二方面，本专利技术根据第一方面提供一种方法，进一步包括(3)一种或多种经选择以促进或保护上述一种或多种酶的折叠而不阻止该朊病毒蛋白被切割的因子。目前公认分子量低于27kDa的蛋白是非感染性和安全的，因此本专利技术的方法设想将该朊病毒消化或切割成片段，其中至少90％，优选至少98％片段的分子量低于27kDa，优选低于25kDa，更优选低于23kDa。但是如果将来发现低于27kDa的蛋白质具有感染性，那么本专利技术的方法可用于将该蛋白质切割成任何安全大小的片段。本文中所用的术语“因子(agent)”根据上下文的需要既包括化学试剂如阴离子表面活性剂、调节pH值的试剂，也包括实现物理和/或热力学条件如压力、温度、辐射的非化学因子，以及促进折叠或解折叠的其它能量影响因素。折叠因子有时被称为“重折叠”因子。解折叠因子有时被称为“变性”因子。第三方面，本专利技术根据第一或第二方面提供一种方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，所述方法包括采用以下组合处理被ＰｒＰ↑［Ｓｃ］朊病毒蛋白或其替代物污染的表面、悬浮物或溶液的步骤：（１）一种或多种有效地将朊病毒蛋白切割成具有非感染性分子量的片段的酶，和（２）一种或多种经选择有利于ＰｒＰ↑［Ｓｃ］朊病毒蛋白构象解折叠而不使所述一种或多种酶变性的因子。

【技术特征摘要】
AU 2001-2-7 PR29381.一种方法，所述方法包括采用以下组合处理被PrPSc朊病毒蛋白或其替代物污染的表面、悬浮物或溶液的步骤(1)一种或多种有效地将朊病毒蛋白切割成具有非感染性分子量的片段的酶，和(2)一种或多种经选择有利于PrPSc朊病毒蛋白构象解折叠而不使所述一种或多种酶变性的因子。2.根据权利要求1的方法，其中选择所述处理以导致在切割后产生预定百分比的具有小于预定分子量的分子量的蛋白质片段。3.根据权利要求1或2的方法，其中经过切割后至少90％的蛋白片段具有低于27kDa的分子量。4.根据权利要求1或2的方法，其中经过切割后至少90％的蛋白片段具有低于25kDa的分子量。5.根据权利要求1或2的方法，其中经过切割后至少90％的蛋白片段具有低于23kDa的分子量。6.根据权利要求1的方法，在组合中还包括(3)一种或多种经选择用于促进或保护所述一种或多种酶折叠同时不阻止朊病毒蛋白被切割的因子。7.根据前述权利要求之任一项的方法，其中所述的一种或多种经选择以有利于构象解折叠的因子包括一种或多种选自以下的因子辐射、电场、磁场、能量振动及其组合。8.根据权利要求7所述的方法，其中能量振动是超声、电磁或机械振动中的一种或多种。9.根据前述权利要求之任一项的方法，其中所述的一种或多种酶选自蛋白酶和具有蛋白水解活性的酶。10.根据前述权利要求之任一项的方法，其中经选择用于促进解折叠的一种或多种因子选自热、pH、倾向于使蛋白变性的有机溶剂、离液剂、倾向于结合蛋白的表面活性剂、作为强蛋白变性剂的无机盐、导致S-S键断裂的因子、对氨基酸的亲水残基具有强亲和力的物质、对氨基酸的疏水残基具有强亲和力的物质、促进表面吸附的物质、阴离子型表面活性剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：S克里茨勒，A萨瓦，M扎鲁纳多，
申请(专利权)人：诺瓦制药研究澳大利亚股份有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]