一种从霞水母刺丝囊毒素内分离热激蛋白60的方法技术

本发明专利技术涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种分离纯化热激蛋白60(Heat?Shock?Protein?60，Hsp60)的方法。其分离方法如下：水母刺丝囊细胞经超声破碎提取得到水母粗毒素，透析除盐后先后利用阴离子交换和凝胶过滤技术分离到Hsp60，测得其分子量为60kDa，本发明专利技术具快速、简便的特点，为获得Hsp60蛋白提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种从霞水母刺丝囊毒素内分离热激蛋白60的方法
本专利技术涉及生物技术，具体的说是一种从霞水母(Cyaneanozakii)刺丝囊细胞毒素中分离纯化热激蛋白60(HeatShockProtein60，Hsp60)的方法。
技术介绍
热激蛋白(Hsp)又称热休克蛋白或应激蛋白，是细胞在应激原刺激下所生成的一组蛋白质。根据其分子量的大小可将Hsp分为高分子量热激蛋白(HMW-Hsp)和低分子量热激蛋白(LMW-Hsp)。HMW-Hsp主要合成于哺乳动物、昆虫和酵母等细胞中，可以和激素结合，维持其特殊构象，LMW-Hsp主要合成于植物中。按照SDS电泳的表观分子量大小可以把Hsp分为五大类：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60及小分子量热激蛋白sHsp。Hsp的生理功能一致认为其具有分子伴侣作用，即协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累并协助蛋白质跨膜转移，与未折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力，维持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解；在蛋白质从头折叠及应激条件下能起到稳定多肽链、防止蛋白质失活的作用。它参与靶蛋白活性和功能调节，却不是靶蛋白的组成部分。热激蛋白的提取纯化方法根据不同的材料其具体方法也不尽相同，例如从鲤鱼的肝脏中提取热激蛋白的方法是，先将鲤鱼肝脏组织破碎后超声波破碎提取，然后在将其盐析后上DEAE纤维素离子交换层析和凝胶过滤G75后获得Hsp70。此外有人采用低渗匀浆、超速离心、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-Agarose亲和层析和DEAE离子交换的亲和层析，从热处理的小鼠肝癌细胞中分离纯化到Hsp70。还有研究者用腺苷二磷酸琼脂糖柱免疫亲和层析法从水牛淋巴细胞中纯化到Hsp70。但是到目前为止还很少有关Hsp60的提取研究报道。Hsp60是热激蛋白重要的成员之一，它的结构高度保守，在电子显微镜照片上，Hsp60分子均由14个亚基组成，每七个亚基构成一个环状，整体结构象两个面包圈垒成的桶，这个桶的内腔为折叠蛋白提供了一个保护性环境。Hsp60s最重要的功能之一就是作为分子伴侣参与新生肽链的折叠、寡聚蛋白质组装和蛋白质的跨膜运输线粒体。Hsp60主要参与核编码的运输入线粒体的蛋白质的加工、定位和装配。它还能够影响线粒体膜上F1-ATP酶复合体的装配和线粒体蛋白FieskeFe/s和eytobz正确加工和定位。叶绿体内Hsp60是由核基因编码，在非热激条件下含量很高。Hsp60另一重要功能是在胁迫下的起到保护作用。当在热激或是外界刺激下，体内变性蛋白急剧增加，此时Hsp60可与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态，在有Mg2+和ATP存在下能够使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象，或者降解。霞水母属刺胞动物门，钵水母纲，旗口水母目，霞水母科，触须4m-6m.广泛分布于我国沿海，尤其夏季会在近海区域集中出现，给渔业生产、生态环境以及游泳者都造成了严重的影响，尤其是毒素能使被蜇伤者出现皮疹、瘙痒、水肿、肌肉疼痛、血压降低、呼吸困难甚至死亡等现象。水母毒素中含有重要的功能蛋白和生物活性蛋白，其中科学家已经从其中分离出具有溶血活性、神经毒性以及致死活性的蛋白质(文献1：Chung，J.J.，etal，2001.Partialpurificationandcharacterizationofahemolysin(CAH1)fromHawaiianboxjellyfish(Carybdeaalata)venom.Toxicon39，981-990.文献2：Sanchez-Rodriguez，Jetal.Partialpurificationandcharacterizationofanovelneurotoxinandthreecytolysinsfromboxjellyfish(Carybdeamarsupialis)nematocystvenom.ArchivesofToxicology，2006，80：163-168.文献3：Nagai，Hiroshietal，IsolationandCharacterizationofaNovelProteinToxinfromtheHawaiianBoxJellyfish(SeaWasp)Carybdeaalata，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications.2000，275：589-594)，但是到目前为止还没有从霞水母毒素中分离到热激蛋白60的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种从霞水母刺丝囊毒素内分离热激蛋白60(Hsp60)的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法：1)将从霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后低温离心，收集上清液，待用；2)步骤1)所得上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素于2-6℃下对pH7.820mMTris-HCl缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；3)将步骤2)所得上清液过滤，而后将其上含DEAESepharoseFastFlow的阴离子交换树柱进行分离，首先采用pH7.820mMTris-HCl缓冲液洗脱，而后采用含有浓度分别为0.1-2M不同浓度的NaCl的pH7.820mMTris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，而后用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩，待用；4)将步骤3)用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩的浓缩物用凝胶树脂Superdex75柱纯化分离，采用含有浓度为0.15-0.5M的NaCl的pH7.820mMTris-HCl缓冲液洗脱，流速为0.2-0.5mLmin-1，收集各洗脱峰，其中流出体积50mL-80mL内的组分(第一个洗脱峰)即为热激蛋白60。所述步骤1)霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞为：将置于-80至-20℃的低温下保存的霞水母触手于2-6℃自溶12-48h，自溶后利用20-60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2-6℃下10000-15000g离心5-20min，收集下部沉淀，2-6℃冷冻干燥，待用，所述步骤1)霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入pH7.820mMTris-HCl预冷缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200-400kw下破碎20-60min中，工作/间隙为5s/30s。所述步骤2)离心条件为在2-6℃下，10000-15000g离心5-20min。所述步骤3)中的过滤时将步骤2)收集的上清液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤。本专利技术的优点：1.本专利技术从霞水母中分离纯化热激蛋白60的方法，为获得Hsp60提供了新的方法。2.本专利技术采用阴离子交换剂DEAESepharoseFastFlow和Superdex75分离纯化Hsp60，具有流速快、分辨率高的特点，而且分离步骤少，只经过两步柱层析分离就能够得到较纯的Hsp60，有效地缩短了分离时间，减少了Hsp60的活性损失。附图说明图1为本专利技术实施例提供的阴离子交换剂DEAESepharoseFastFlow分离霞水母毒素层析图。图2为本专利技术实施例提供的分子筛Superdex75分离DEAESepharoseFastFlow0.3M洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白６０的方法，其特征在于：１）将从霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后低温离心，收集上清液，待用；２）步骤１）所得上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素于２－６℃下对ｐＨ７．８２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；３）将步骤２）所得上清液过滤，而后将其上含ＤＥＡＥ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ的阴离子交换树柱进行分离，首先采用ｐＨ７．８２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液洗脱，而后采用含有浓度分别为０．１－２Ｍ不同浓度的ＮａＣｌ的ｐＨ７．８２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，而后用截留分子量为３ｋＤａ的超滤管浓缩，待用；４）将步骤３）用截留分子量为３ｋＤａ的超滤管浓缩的浓缩物用凝胶树脂Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５柱纯化分离，采用含有浓度为０．１５－０．５Ｍ的ＮａＣｌ的ｐＨ７．８２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液洗脱，流速为０．２－０．５ｍＬｍｉｎ－１，收集各洗脱峰，其中流出体积５０ｍＬ－８０ｍＬ内的组分即为热激蛋白６０。

【技术特征摘要】
1.一种从霞水母刺丝囊毒素中分离热激蛋白60的方法，其特征在于：1)将从霞水母触手中得到的霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后低温离心，收集上清液，待用；2)步骤1)所得上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素于2-6℃下对pH7.820mMTris-HCl缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；3)将步骤2)所得上清液过滤，而后将其上含DEAESepharoseFastFlow的阴离子交换树柱进行分离，首先采用pH7.820mMTris-HCl缓冲液洗脱，而后采用含有浓度分别为0.1-2M不同浓度的NaCl的pH7.820mMTris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，而后用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩，待用；4)将步骤3)用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩的浓缩物用凝胶树脂Superdex75柱纯化分离，采用含有浓度为0.15-0.5M的NaCl的pH7.820mMTris-HCl缓冲液洗脱，流速为0.2-0.5mLmin-1，收集各洗脱峰，其中流出体积50mL-80mL内的组分即为热激蛋白60。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏程，李荣锋，于华华，冯金华，邢荣娥，刘松，秦玉坤，李克成，孟祥涛，崔金会，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95