肥大细胞脱颗粒的直接监测方法技术

本发明专利技术属于药物检测领域，涉及一种通过肥大细胞脱颗粒的直接监测测定过敏物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，转染了CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞和过敏物质放到一起培养，步骤2，用显微镜扫描采集培养物的图像，步骤3，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药检测
，特别涉及一种测定引起类过敏反应的物质的方法。
技术介绍
过敏反应为常见的不良反应之一。过敏反应即变态反应，是外源性抗原物质与体内抗体间所发生的一种非正常的免疫反应。可以诱发过敏反应的物质很多，如蛋白质、多肽、多糖等大分子物质具有完全的抗原性；另一些分子较小的化合物可作为半抗原与体内蛋白质结合成全抗原，从而引起过敏反应。目前涉及到过敏反应的过敏物质很多，发生频率较高的有药品(中药及西药)、食品、花粉、螨虫等。最新调查研究表明，77 %的急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发生率远高于I型超敏反应。类过敏反应无需IgE介导，首次接触药物即可出现过敏症状，给人类的生活带来及大的危害。类过敏反应属于非免疫反应，无免疫系统参与，不需接触抗原物质，也无抗体参与，首次用药即可激发，外来物质直接刺激肥大细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒，释放大量组胺， 由此产生过敏症状。因此，肥大细胞脱颗粒是类过敏反应中最直接、最重要的环节。肥大细胞的脱颗粒过程是由一系列步骤组成的，它包括囊泡的转运、定向、锚定、 融合等环节，每一个环节均受到严格调控。因此直接观察囊泡的运动方向监测其与膜融合的过程无疑是动态观察脱颗粒的最直接方法，但目前还没有一个合适的方法对其进行评估。RBL-2H3细胞是离体实验中常用的大鼠肥大细胞株，具有与在体肥大细胞相似的反应特性，因此，常被做为过敏反应的离体研究对象。在本专利技术中，绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein, GFP)与囊泡表面的标志性表面分子CD63基因融合，使RBL-2H3细胞(离体实验中最常规使用的大鼠肥大细胞株)特异性表达GFP-⑶63分子，使囊泡具有可识别的绿色荧光，利用全内反射显微镜成像技术，通过对囊泡与细胞膜融合释放活性物质的直接观察，评估肥大细胞脱颗粒的程度，从而建立一种直接观测方法。该方法在活细胞状态下，直观、灵敏、快速对致敏原进行筛选，克服了原有方法的不足，将为过敏原过敏性筛查、过敏原检测、环境安全性监测等领域提供新的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种通过肥大细胞脱颗粒的直接监测测定过敏物质的方法，该方法包括以下步骤步骤1，转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞和过敏物质放到一起培养，步骤2，用显微镜扫描采集培养物的图像，步骤3，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。优选的方法包括以下步骤步骤1，转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，步骤2，将培养液换为台氏液，孵育；步骤3，加入过敏物质用显微镜扫描采集图像，步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。更优选的方法包括以下步骤步骤1，将转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，培养 24h ；步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入过敏物质后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。更优选的方法还可以是以下方法，包括以下步骤步骤1，将转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，培养 24h ；步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入过敏物质后移至全内反射显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像，共采集20min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。本专利技术所述的过敏物质包括但不限于以下物质药物，花粉，食物，螨虫，细菌，微生物，植物等。本专利技术针对药物中的过敏物质具有特别优越的价值，如药物的注射剂，特别是针对中药的注射剂如双黄连粉针、清开灵注射液、穿琥宁注射液、参麦注射液、鱼腥草注射液寸。本专利技术的方法经过以下实验证明本专利技术的方法比现有技术优越1 材料试剂MEM 培养基(GIBC0，美国)；Compound48/80 (Sigma,美国)；CD63-GFP 质粒；Iipofect转染试剂(Tiangen Biotech，中国)；无内毒素质粒提取试剂盒(Tiangen Biotech，中国)；E. coli感受态大肠杆菌(Tiangen Biotech，中国)；大鼠嗜碱性细胞细胞株RBL-2H3细胞购自协和细胞库，使用MEM培养基进行常规培养。仪器二氧化碳培养箱(Thermo 371，美国)；超净工作台(苏州净化，中国)；激光扫描共焦显微镜及全内反射显微镜(Olympus FV1000,日本)；PCR仪(英国TechneTC-512)2 方法2. 1CD63-GFP RBL-2H3 细胞的构建2. 1. 1CD63-GFP融合基因的构建CD63全长cDNA是从RBL-2H3细胞中应用逆转录PCR反应扩增获得。上游引物为 AGCTTCGAATTCatggc ggtggaagga ggaatg (EC0R I)，下游引物为ACCGGTGGATCCCGCATTACTTCATAGCCACTTCGA (BamH I)。CD63 cDNA通过EcoR I和BamH I双酶切后与经相同酶切后的 pEGFP-Nl质粒链接，后克隆入感受态E. coli DH5a中，构建成⑶63-GFP E. coli，抗生素筛选后，增菌，进行测序验证。2. 1. 2质粒提取增菌后，用质粒提取试剂盒提取质粒，具体过程按说明书所示。2. 1. 3 转染体外扩增质粒后按照DNAfection试剂盒说明书将质粒转染至RBL-2H3细胞内。 转染后使用不含青链霉素的MEM培养液进行培养。7 后培养液中加入G418 (G418浓度为 0. 6ug/ml)进行筛选。待筛选至有荧光的细胞达到50%左右时，利用流式细胞仪对细胞进行分选，纯化后，传代，得稳定表达细胞株。2. 2本专利技术的肥大细胞脱颗粒的活体检测方法2. 2. ITIRFM观察将RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜IOOX油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后切换至TIRFM扫描模式，开始连续扫描采集图像，曝光时间0. Is, Is采集一张图片，连续采集20min。compound48/80及阴性对照药(细胞培养液)分别均在图像采集前加入。2. 2. 2激光扫描共聚焦显微镜将RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h 后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜IOOX油镜下观察。 选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每隔IOs采集一张图像，共采集40min。COmpOimd48/80及阴性对照药(细胞培养液)分别均在图像采集前加入。4 结果4. 1CD63-GFP RBL-2H3 细胞株的建立转染了 GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488n本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种通过肥大细胞脱颗粒的直接监测测定过敏物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤１，转染了ＣＤ６３－ＧＦＰ质粒的ＲＢＬ－２Ｈ３细胞和过敏物质放到一起培养，步骤２，用显微镜扫描采集培养物的图像，步骤３，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，王丹巧，胡剑江，张倩，侯燕鸣，雷洪涛，于友华，李连达，
申请(专利权)人：中国中医科学院医学实验中心，
类型：发明
国别省市：11