本发明专利技术公开了一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒。该免疫学方法为间接酶联免疫技术，即通过人工合成抗原包被无铅抗原结合样品中的铅离子，形成含铅抗原；含铅抗原与抗铅单克隆抗体反应形成抗原-铅-抗体结构链；接着再与酶标记的二抗反应，形成抗原-铅-抗体-二抗的结构链；通过显色反应，由显色程度判断所检样品中的铅离子含量。实现该免疫学方法的试剂盒包含包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板和抗铅单克隆抗体，人工抗原指的是CHX-A”-DTPA-OVA；抗铅单克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCC?C201084、名称6H8/4F7的单克隆细胞株产生。本发明专利技术首次将间接酶联免疫检测技术用于小分子检测中，检测效果好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术特别涉及一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒，可用于环境 农产品中重金属铅离子残留快速检测。
技术介绍
近年来，由于工业废水、矿厂开发废弃物等的大量释放，造成了我国土壤和水体中 重金属污染物残留迅速增长，并直接影响到了农产品和水产品的质量安全。重金属元素可 在动物植物体内富集并通过食物链最终转移至人体。因误食含有重金属污染物残留的农产 品和水产品而造成人类中毒事件时有发生。这也表明，目前我们迫切需要对环境农产品和 水产品的质量进行长期有效的监测，以保证其食用安全性。传统上，环境农产品中重金属残留的检测技术主要依靠大型仪器，如原子吸收分 光光度法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱分析、原子荧光 光谱分析等，这些重金属检测方法虽然能精确测量样品中重金属含量，但检测相对费时、费 力、且费用昂贵，此外，这些方法需大量的样品预处理，并在大型分析设备上进行，需要专业 人员操作，难以应用于现场检测。由于上述的不足之处，检测的样品数一般会少于最佳检测 数量，导致在随后进行的重金属污染程度和风险的评估工作存在较大的不确定性，受污农 产品的监管也难以及时有效开展。重金属免疫检测技术，是采用人工制备的抗重金属抗体与抗原之间的免疫反应为 基础，通过酶联免疫系统信号放大作用，快速准确的表达所检样品中重金属含量。重金属免 疫检测技术在国外研究较早。自Reardan首次通过重金属_螯合剂复合物制备出单克隆抗 体以来，越来越多的抗重金属抗体被制备出来，并成功建立了相应的免疫监测系统。目前， 这一技术多采用间接竞争酶联免疫方法(IC-ELISA)。IC-ELISA用于检测重金属铅，虽然可 达到较高的检测水平，但是其成本过高(需要过量昂贵的螯合剂)，而很难真正应用于产品 生产当中。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速检测重金属铅 离子的的免疫学方法。本专利技术的另一目的在于提供实现所述免疫学方法的试剂盒。该专利技术的目的通过下述技术方案实现一种快速检测重金属铅离子的的免疫学方 法，包含以下步骤采用间接酶联免疫技术，即通过人工合成抗原包被无铅抗原结合样品中 的铅离子，形成含铅抗原；含铅抗原与抗铅单克隆抗体反应形成抗原-铅-抗体结构链；接 着再与酶标记的二抗反应，形成抗原-铅-抗体-二抗的结构链；然后通过显色反应，由显 色程度判断所检样品中的铅离子含量；所述的人工合成抗原指的是CHX-A”-DTPA-OVA，该人工合成抗原是由OVA(卵白蛋 白)偶联重金属螯合剂CHX-A”-DTPA，经室温振荡反应M小时候，采用超滤法纯化而得；3所述的抗铅单克隆抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国湖北省 武汉市武汉大学内)、保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCCC201084、名称为杂 交瘤细胞株6H8/4F7的单克隆细胞株制备得到；所述快速检测重金属铅离子的的免疫学方法，更具体包含以下步骤将人工合成抗原CHX-A”-DTPA-OVA包被于酶标板微孔内，加入量为100 400ng/ well ；接着封闭，再加入待检样品，于37°C反应至少5min，PBST溶液洗涤，再加入抗铅单克 隆抗体，每孔加入100 500ng，于37°C孵育至少30min ；再用PBST溶液洗涤，加入酶标记的 羊抗鼠IgG，加入量为每孔10 12. 5ng/Well，于37°C孵育至少30min后用PBST溶液洗涤， 再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析；所述的封闭优选为使用质量百分比3%牛血清白蛋白(BSA)溶液进行封闭，于 37 °C 孵育 Ih ；所述PBST溶液的组成优选为由0. 01M、pH值为7. 4的PBS缓冲液与Tween-20按 体积比1000 0.5混合得到;所述抗铅单克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCCC201084、 名称6H8/4F7的单克隆细胞株制备得到；所述酶标记的羊抗鼠IgG优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG ；实现所述免疫学方法的试剂盒包含包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板、抗铅 单克隆抗体、酶标记的羊抗鼠IgG和底物，其中，人工抗原指的是CHX-A”-DTPA-OVA ；抗铅单 克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCC C201084、名称6H8/4F7的单 克隆细胞株制备得到；所述包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板优选通过以下步骤制备得到将人工 合成抗原CHX-A”-DTPA-0VA包被于酶标板微孔内，人工合成抗原CHX-A”-DTPA-OVA的加入 量为lOOng/well ；接着用质量百分比为3%的BSA封闭，于37°C孵育lh，于吸水纸上拍干， 用PBST溶液洗涤3次得到；所述PBST溶液的组成优选为由0. 01M、pH值为7. 4的PBS缓冲 液与Tween-20按体积比1000 0. 5混合得到；所述酶标记的羊抗鼠IgG优选为HRP标记的羊抗鼠IgG ；使用浓度优选为IOOng/ ml ο所述的底物优选为TMB (3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺)显色底物，使用浓度优选为 100 150μ g/ml。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本专利技术首次将间接酶联免疫检测技术(I-ELISA)用于小分子检测中，不仅保 留了免疫检测技术的灵敏度和准确性，而且也达到了降低制造成本的目的，真正完成了将 ELISA技术应用于环境重金属铅残留的现场快速检测当中。(2)本专利技术首次成功制备出重金属铅酶联免疫检测试剂盒，并在实验水平下完成 了水样品检测检验，达到了现有铅离子检测水平。附图说明图1是本专利技术可行性的检测结果图。图2是杂交瘤细胞株培养上清特异性实验结果。图3是重金属铅离子免疫检测系统标准曲线。图4是重金属铅离子免疫检测试剂盒样品反应时间测定结果。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。实施例1用本专利技术所述的免疫学方法检测重金属铅离子(1)单克隆抗体溶液的制备①人工抗原的合成选择与小鼠亲缘关系较远的钥孔戚血蓝蛋白(KLH)作为免疫载体，选择卵白蛋白 (OVA)作为检测载体。1)母液配备A液称取12mg CHX_A”-DTPA(二乙基三胺五乙酸)溶于Iml纯水中，加热至60°C，溶解；B液称取17mg Pb (NO3) 2溶于200 μ 1体积百分比2 %的稀硝酸中；C 液称取 IOmg OVA 溶于 ^nl HEPES (IOmM, ρΗ9· 0)中，置于 4°C ；D 液量取 850 μ 1 KLH (5. 8mg · ml—1)，置于 4°C保存备用。2)免疫抗原制备取30 μ 1步骤1) B液逐滴加入350 μ 1步骤1) A液中，室温振荡反应4h，得到半抗 原。将半抗原加入到D液中，并加入5 μ 1三乙胺，室温振荡反应过夜，得到免疫抗原。3)检测抗原的制备将步骤1)C液分装两支离心管，每支装1ml，标记为Cl和C2 ；每支管中均加入 350 μ 1步骤1) A液。再取30 μ 1 B液加入到Cl离心管中。将步骤2)和3)中获得的三组溶液均用HEPES缓冲液(10mM，pH9. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种快速检测重金属铅离子的的免疫学方法，其特征在于包含以下步骤：采用间接酶联免疫技术，即通过人工合成抗原包被无铅抗原结合样品中的铅离子，形成含铅抗原；含铅抗原与抗铅单克隆抗体反应形成抗原－铅－抗体结构链；接着再与酶标记的二抗反应，形成抗原－铅－抗体－二抗的结构链；然后通过显色反应，由显色程度判断所检样品中的铅离子含量；所述抗铅单克隆抗体由保藏日期为２０１０年８月２５日、保藏编号为ＣＣＴＣＣＣ２０１０８４、名称为６Ｈ８／４Ｆ７的单克隆细胞株产生。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江天久，包财，秦超，王晔，
申请(专利权)人：暨南大学，百奥泰生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：81
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