铬离子抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了铬离子抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的制备铬离子抗原的方法，包括如下步骤：(1)将螯合剂进行重氮化反应，得到重氮化螯合剂；(2)将所述步骤(1)得到的重氮化的螯合剂与载体蛋白进行偶联反应，得到偶联产物；(3)将所述步骤(2)得到的偶联产物与铬离子进行络合反应，得到络合物，即得到铬离子抗原。本发明专利技术所提供的制备铬离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铬离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明专利技术方法制备的铬离子抗原进行免疫得到的抗体特异性好、最低检测限值低。因此，本发明专利技术所提供的制备铬离子抗原的方法以及由该方法获得的铬离子抗原，将在铬离子的酶联免疫检测中有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及铬离子抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
铬是国内外食品、药物、环境等样品中重要的污染物质之一。重金属铬在环境中主要以三价铬和六价铬的形式存在。其中，六价铬的毒性比三价铬高得多，对皮肤粘膜有刺激和腐蚀作用，并且更容易为人体吸收、蓄积，已被确认为致癌物，因此，重金属铬的摄入量及其价态对人体健康有很大影响。重金属铬的化合物广泛应用于制革、冶金、纺织品生产及镀铬等行业，环境中的铬含量在不断的增加，因此，重金属铬也成为各国环境监测中的必测元素，六价铬的测定方法也受到环境监测者的广泛关注。铬的测定方法较多，主要有分光光度法、化学发光法、原子吸收光谱法、荧光分析法、电化学分析法和离子色谱法等。这几种仪器检测方法检测重金属铬的含量不仅需要昂贵的仪器设备，而且检测费用高、检测时间长和检测步骤繁杂，不能用于现场的快速检测。 免疫检测技术已被广泛应用于毒素、杀虫剂、炸药等的环境污染和危险物的检测，与其他检测系统相比，免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏和特异的优点，可便携进行现场检测。免疫检测试剂盒可以快速检测某一特定物质的含量，但要将免疫分析法应用到检测重金属铬离子，必须制备相应的抗原和抗体。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种制备铬离子抗原的方法。本专利技术所提供的制备铬离子抗原的方法，包括如下步骤(1)将螯合剂进行重氮化反应，得到重氮化螯合剂；(2)将所述步骤(1)得到的重氮化的螯合剂与载体蛋白进行偶联反应，得到偶联产物；(3)将所述步骤(2)得到的偶联产物与铬离子进行络合反应，得到络合物，即得到铬离子抗原。所述步骤(1)中所述重氮化反应的方法包括以下步骤将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，得到溶液I ；再向所述溶液I中加入亚硝酸盐水溶液，得到溶液II ；将所述溶液II在温度为0°c -5°c或0°C或4°C或5°C、避光和反应时间为15min的条件下进行反应，即得到所述重氮化螯合剂。所述步骤O)中所述载体蛋白与所述重氮化螯合剂的投料摩尔比为1 (5-25) 或 1 10 或 1 5 或 1 25 ；所述偶联反应是在温度为4°C -10°C或4°C或7°C或10°C和反应时间为4h_24h或 12h或4h或24h的条件下进行；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或人血清白蛋白或血蓝蛋白。所述步骤(3)中所述偶联产物与所述铬离子的投料摩尔比为1 (1-10)或1 3或 1 1 或 1 10 ；所述络合反应是在温度为4°C _25°C或25°C或4°C或15°C、pH值为7. 0-8. 0或7. 0 或7. 5或8. 0和反应时间为4h-24h或1 !或4h或Mh的条件下进行。所述步骤(1)中所述的螯合剂与所述酸的投料摩尔比为1 G-10)或1 10或 1 7 或 1 4 ；所述螯合剂与所述亚硝酸盐的投料摩尔比为1 (1- 或1 2或1 1或1 3;所述螯合剂为对氨基苯甲基乙二胺四乙酸；所述的酸为盐酸或硫酸或硝酸或过氯酸或氟硼酸；所述亚硝酸盐为亚硝酸钠。所述步骤O)中所述偶联反应还包括将所述偶联产物进行透析，得到纯化的偶联产物的步骤；所述进行偶联反应前，还包括将所述载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲液中的步骤。所述步骤(3)中，还包括将所述络合物进行透析的步骤。根据所述方法制备得到的铬离子抗原也属于本专利技术的保护范围。由所述铬离子抗原制备得到的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述铬离子抗原和/或所述抗体在检测铬离子中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所提供的制备铬离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铬离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本专利技术方法制备的铬离子抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。因此，本专利技术所提供的制备铬离子抗原的方法以及由该方法获得的铬离子抗原，将在铬离子的酶联免疫检测中有广阔的应用前景。附图说明图1为铬离子抗原的合成路线图。图2为以EDTA-Cr为标准样品建立的铬离子间接ELISA法标准曲线。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。对氨基苯甲基乙二胺四乙酸(购自Sigma公司，商品目录号为A3473)；羊抗鼠 IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为79556)；弗氏完全佐剂(购自Sigma公司，商品目录号为F5881)；弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，商品目录号为F5506) ；EDTA(购自 Sigma公司，商品目录号为E6758)；牛血清白蛋(购自Sigma公司，商品目录号为A7906)； 卵清白蛋白(购自Sigma公司，商品目录号为A5503)，CrCl3 · 6H20 (购自Sigma公司，商品目录号为27096)；其余HCl、K2C03、NaN02和甘油等常规试剂均购自北京化学试剂公司。实施例1、铬离子抗原及其制备一、铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白(Cr-对氨基苯甲基 EDTA-BSA)抗原的制备方法I铬离子抗原的合成路线图如图1所示。1、对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的重氮化(1)称取固体对氨基苯甲基乙二胺四乙酸1.985mg，充分溶解于0. 5mL 0. IM的 HCl水溶液中，得到溶液I。溶液I中，对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与HCl的投料摩尔比为 1 10。(2)将上述步骤(1)得到的溶液I在4°C避光条件下进行搅拌，每间隔30s向溶液 I中滴加30 μ L质量百分含量为1 %的NaNO2水溶液，得到溶液II。NaNO2的加入量是过量的，即对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与NaNO2W投料摩尔比为1 2。用淀粉-碘化钾试纸对上述步骤( 得到的溶液II进行检验，在试纸变蓝后，反应15分钟，得到重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸溶液。2、重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白进行偶联(1)称取牛血清白蛋(BSA) 33. Omg，充分溶解于2. OmL 0. 05M的碳酸盐缓冲液中， 得到溶液III。0. 05M的碳酸盐缓冲液配制方法如下将1. 5gNa2C03和2. 93gNaHC03溶解于蒸馏水中，用蒸馏水定容至lOOOmL，pH值为 9. 6。(2)将上述步骤1获得的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸溶液逐滴加入上述步骤(1)的溶液III中，使BSA与重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的投料摩尔比为1 10， 得到溶液IV。(3)偶联反应在4°C下，将上述步骤(2)的溶液IV搅拌过夜(12小时)，得到偶联产物溶液。(4)偶联反应12小时后，将上述步骤(3)得到的偶联产物溶液置于透析袋中，用 PH为7. 5的磷酸盐缓冲液透析2天，每天换3次透析液，得到纯化的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白的偶联物。上述pH为7. 5磷酸盐缓冲液的配制方法如下将8. Og NaCUO. 2g KH2PO4 和 2. 96g Na2HPO4 · 12H20，溶解于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至lOOOmL。3、铬离子的络合(1)称取4. OOmg CrCl3 · 6H20，用超纯水配制成0. IM CrCl3水溶液。将步骤2得到的纯化的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白的偶联物溶液用IM的HCl将其 PH值调节到7. 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种制备铬离子抗原的方法，包括如下步骤：（１）将螯合剂进行重氮化反应，得到重氮化螯合剂；（２）将所述步骤（１）得到的重氮化的螯合剂与载体蛋白进行偶联反应，得到偶联产物；（３）将所述步骤（２）得到的偶联产物与铬离子进行络合反应，得到络合物，即得到铬离子抗原。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，孙硕，赵洪伟，南铁贵，高巍，谭桂玉，王敏，曹振，何丽珊，张炜，李召虎，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11