一种生物检测技术领域的基于耐高温RNase?HII的单核苷酸多态性检测方法，其涉及的分子信标序列为：5’-(FAM)CCGACG?X7-13yX7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中：y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。对应的扩增目标序列的引物为：HLA-A-F：5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’/HLA-A-R：5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。本检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物检测
的方法，具体是一种。
技术介绍
核酸检测和SNP分析已经是一个很大的产业。这些技术不仅在科学研究上获得广泛的应用，在临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显，例如利用SNP 可以更好的理解遗传疾病的复杂基础，实现药物治疗。现今的核酸检测和SNP分析技术种类多样，然而目前的方法仍然存在费时费力，通量不高和步骤繁琐等问题，因此SNP检测的高通量与灵敏度，以及简单操作、缩短检测时间目前仍是基因和SNP检测的发展方向。经过对现有技术的检索发现，HouJ，Liu X，Zheng Y，Liu J. A method for HLA genotyping using the specific cleavage of DNA-rNl-DNA/DNA with RNase HII from Chlamydia pneumoniae Oligonucleotides (禾用 Chlamydia pneumoniae 核 Il t亥酸 BS HII酶切DNA-rm-DNA/DNA底物的特异性检测SNP的方法研究，2007-12-27 ；Vol 17 (4) 433-443)中记载了 RNase H是一种特异的内切核糖核酸酶，它能够降解RNA/DNA链中的 RNA0目前研究证明RNaseHII能够酶切正确配对的嵌合一个核糖核苷酸的DNA-rN^DNA/DNA 杂合双链，并且衣原体RNaseHII不能酶切这种错配底物或者酶切效率非常低，因此利用衣原体RNaseHII能够实现对SNP的检测。最近研究表明耐高温菌的RNase HII具有与衣原体RNaseHII相似的酶切性质，能够酶切正确配对的DNA-rNfDNA/DNA底物，不能酶切这种错配底物。另外耐高温菌的RNase HII能够耐受高温，因此在SNP检测方面具备比常温RNaseHII更广泛的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供一种，检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及一种分子信标，其序列为5’ -(FAM)CCGACG X7_13yX7_13CGTCGG (Dabcyl)-3’，其中y表示任意a，u，c, g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl。分子信标5’端6_8个核苷酸与3’端6_8 个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，荧光基因不能发出荧光。分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对。除了 5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对；本专利技术上述分子信标的扩增目标序列的引物，由特异性正向引物和反向引物组成，其序列分别为HLA-A-F :5’ -GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’HLA-A-R 5，-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3，。本专利技术涉及一种，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、 vent (_exo) DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。所述的扩增是指采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(PCR)扩增双链DNA，将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶中，利用胶回收试剂盒回收扩增的目标片断；其中的聚合酶链式反应体系由热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测目标DNA模板分子、待测目标DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶组成。所述的荧光强度检测是指SNP检测反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR。 反应所用的仪器为定量PCR仪，仪器运行前设定检测方法，包括荧光检测基团FAM的设定； 荧光检测区域的设定；反应运行程序的设定95°C X5分钟；(95°C X30秒，49°C X2分， 490C X 10秒荧光检测，72°C X 30秒)X 30循环，其中49°C X 10秒荧光检测表示仪器在此阶段自动检测SNP混合反应物的荧光强度并且自动保存。反应结束后分析检测的荧光信号强度，获得待测目标DNA待测位点单核苷酸多态性。本专利技术与现有SNP测定技术相比有显著的进步。主要优点如下⑴操作简便、结果稳定，只需要进行简单可靠的实时荧光PCR反应；(2)操作通量大，每次可以做96/384个反应；(3)不需要大型昂贵设备，整个操作过程中仅需要定量PCR仪。本专利技术可用于测定各种SNP，包括微生物、植物、动物、人的SNP。附图说明图1基于耐热性RNase HII蛋白的单核苷酸多态性检测方法示意图。图2耐热性RNase HII检测SNP位点的实施例1示意图。具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rsll3699656SNP位点的测定 本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rsl 13699656SNP位点，耐热性RNase HII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下 第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因rsll3699656SNP位点的嵌合分子信标。 2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A274c、A274a，它们序列如下A274c :5，-(FAM)CCGACG CTTCATCGCcGTGGGCTAC CGTCGG(Dabcyl)-3，A274a :5，-(FAM)CCGACG CTTCATCGCaGTGGGCTAC CGTCGG(Dabcyl)-3，其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第16位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rsl 13699656 SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的18个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。第二步，人基因组DNA的抽提。获得的人体新鲜血液加入15g/L EDTA. 2Na的抗凝剂防止血液凝固。血液中加入红细胞裂解液裂解红细胞，并且按照操作说明利用人基因组抽提试剂盒抽提人基因组DNA。第三步，设计合成用于扩增人HLA-A基因片断的特异性引物。正向、反向引物分别为HLA-A-F、HLA-A-R，引物碱基序列如下HLA-A-F :5’ -GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’HLA-A-R :5，-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于耐高温ＲＮａｓｅ ＨＩＩ的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列ＳＮＰ的分子信标、ｖｅｎｔ（－ｅｘｏ）ＤＮＡ聚合酶、耐高温ＲＮａｓｅ ＨＩＩ和不影响耐高温ＲＮａｓｅ ＨＩＩ活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用ＰＣＲ仪进行扩增，定量ＰＣＲ仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标ＤＮＡ的ＳＮＰ类型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯敬丽，张琳，刘建华，梁齐，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。