高粱的高频再生方法技术

本发明专利技术一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本发明专利技术涉及一种高粱再生方法，尤其是Sorghum?bicolor(L.)Moench，通过器官发生获得高频再生。除了提供高频再生之外，本发明专利技术还可直接应用于通过体细胞无性系变异产生高粱变异体和可直接应用于高粱的遗传学转化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本专利技术涉及一种高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicolor(L. )Moench，通过器官发生获得高频再生。本文引用以说明本专利技术背景的公开文献和其它材料，以及尤其是提供关于实施的 附加细节的实例，在此一并引入作为参考，为了方便起见，在下文通过作者、日期引用并且 在所附参考文献中按照作者字母顺序排列。高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)是一种广泛种植的谷类和饲料作物，更紧密 地与原产热带的主要作物相联系，比如大米、玉米、甘蔗和黑黍。高粱在谷类作物产量中居 第五，是热带禾本科植物的重要模型。由于能非常好地适应极端环境，特别是干旱和高温， 因此在主要谷类中是独特的。这些特性使得高粱成为在极端高温和极少降水的地区养活人 类和动物种群的合适的谷物(Howe等2006)。另外，目前国际对经济、环境和能源安全的关 注促使从矿物燃料向生物燃料替代品转变，比如生物乙醇和生物柴油。由于生物燃料能从 多种作物产生，每个国家采取策略开发所拥有作物的比较优势。不同生物燃料作物中，高粱由于其生理和天然因素(包括其事实是光合高效的C4 植物)，被认为是生产生物乙醇更好的选择。可以利用诸如组织培养和转化的生物技术进一 步改良该作物。30多年中，一些报道记录了使用各种外植体使用不同培养基组合物的高粱 再生。这些报道包括高粱植株再生(未成熟胚(Gamborg等1977，Ma等1987,Hagio 2002), 成熟胚的茎叶(shoot)部(Cai等1987)，苗端(Zhong等1988)，成熟胚(Nirwan和Kothari 2003)，根部横向薄层细胞(Baskaran等2006))，体细胞胚发生(未成熟和成熟胚(Rao等 1995,Elkonin 等 1996,MacKinnon 等 1986)，叶基(Mishra和 Khurana 2003))及其转化(未 成熟胚(Zhao等2000，Carvalho等2004)，未成熟和成熟胚，茎尖和胚性愈伤组织(Tadesse 等 2003)和苗端(Giriiashankar 等 2005)，种子(Howe 等 2006))。尽管有这些成功的报道，但是还需要开发用于高粱的新技术。这种技术必须具有 高频再生，其有助于该技术应用于诸如增加生物量或提高糖含量的遗传学操作，以改善该 作物的生物乙醇产量。
技术实现思路
本专利技术一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本专利技术涉及一种高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicolor (L. )Moench，通过器官发生获得高频再生。因此，本专利技术首次提出一种甜高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)的再生方法。 简言之，使用切开的具胚子叶(DEC)外植体通过器官发生再生高粱。本专利技术广泛应用于 甜高粱变种和杂种，此处特别说明是关于甜高粱(Sorghum bicolor (L.)Moench)杂交品种 Liotian ULioza 7050A和LiaoJi Za 1。除了提供高频再生之外，本专利技术还可直接应用于 通过体细胞无性系变异生产高粱变异体和可直接应用于高粱的遗传学转化。根据本专利技术，从中国甜高粱(Sorghum bicolor (L. )Moench)的切开的具胚子叶 (DEC)外植体诱导器官性愈伤组织，并从该器官性愈伤组织再生植株。本专利技术的高频再生系统由六阶段组成阶段1 (愈伤组织诱导)，阶段2和3 (茎叶芽(shoot bud)诱导和减少 酚渗出液)，阶段4 (诱导茎叶芽萌发和伸长)，阶段5 (茎叶伸长和减少酚渗出)以及阶段 6 (生根)。阶段1中MS矿物盐添加N6维生素，在后续阶段MS矿物盐添加B5维生素，并且 在特定阶段改变抗氧化剂(例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP))、 有机添加剂(例如硫酸腺嘌呤(AdSO4))、无机添加剂(例如AgNO3)、氨基酸(例如L-脯氨 酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸)和PGRs (植物生长调节剂)，提高了再生效率并减少高粱组织 培养中固有的高酚化合物渗出。短短三个月内从DEC外植体产生无基因型显著变异的大约 250-300株健康小植株，存活率为100%。附图说明图1A-1I示出了依照本专利技术通过切开的具胚子叶(DEC)的器官发生实现的高粱再 生。图IA和IB示出了子叶节内和周围没有生根和愈伤组织诱导的切开的具胚子叶外植体。 图IC示出了从DEC愈伤组织诱导的茎叶芽。图ID和IE示出了从茎叶芽再生的多个茎叶。图IF示出了再生茎叶的伸长。图G和H出示了伸长的茎叶的生根。图II示出了已炼苗的小植株。具体实施例方式本专利技术一般涉及包括器官发生的高粱再生。更具体地，本专利技术涉及一种高粱再生 方法，尤其是Sorghum bicoloHDMoench，通过器官发生获得高频再生。除了提供高频再 生之外，本专利技术还可直接应用于通过体细胞无性系变异生产高粱变异体和可直接应用于高 粱的遗传学转化。说明书下文，仅仅出于方便考虑，通过参考某些高粱杂种来描述专利技术各方面。用其 它高粱变种和杂种代替提到的高粱杂种是可以理解的。此处提到的“器官发生”是指通过愈伤组织或植物任意部位的直接分生组织在可 控环境条件下在特定培养基内再生茎叶。此处提到的“愈伤组织”是指从任意外植体组织产生的无器官或未分化的增殖细 胞块。根据本专利技术，提供了一种通过器官发生再生高粱的方法，其有效地获得高频的再 生植物。一个实施方案中，从获得自高粱，尤其是Sorghum bicoloHDMoench的具胚子叶 外植体再生植物。将具胚子叶的外植体切开并放入固体培养基中，在此指阶段1的培养基。 在一个实施方案中，阶段1培养基包括MS矿物盐和N6维生素并添加L-脯氨酸和L-谷氨酰 胺。在一个实施方案中，阶段1培养基中添加大约25mg至大约200mgL-脯氨酸，优选大约 50mg至大约IOOmg L-脯氨酸，更优选大约IOOmg L-脯氨酸。另一实施方案中，阶段1培养 基中添加大约50mg至大约250mg L-谷氨酰胺，优选大约50mg至大约IOOmg L-谷氨酰胺， 更优选大约IOOmg L-谷氨酰胺。阶段1培养基还包括植物生长调节剂。在一个实施方案 中，植物生长调节剂是生长素和脱落酸(ABA)。优选实施方案中，生长素是二氯苯氧基乙酸 (2，4-D)。一个实施方案中，阶段1培养基中ABA浓度是大约0. 94 μ M至大约18. 9 μ Μ，优选 大约0. 94 μ M至大约7. 56 μ Μ,更优选大约3. 78 μ Μ。另一实施方案中，阶段1培养基中2， 4-D浓度是大约2. 26 μ M至大约9. 04 μ Μ,优选大约4. 52 μ M至大约6. 78 μ Μ,更优选大约6. 78 μ M0阶段1培养基还包括碳源。在一个实施方案中，碳源是大约2%至大约5%，优选 大约2 %至大约3 %，更优选大约3 %的蔗糖。另一实施方案中，碳源是大约2 %至大约5 %， 优选大约3 %至大约5 %的葡萄糖。另一实施方案中，碳源是大约2 %至大约5 %，优选大约 2%至大约3%的果糖。又一实施方案中，碳源是大约2%至大约5%，优选大约2%至大约 3%的麦芽糖。另一实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种经由器官发生再生高粱的方法，其包括步骤：（ａ）在第一培养基中培养高粱外植体，所述第一培养基包括ＭＳ矿物盐、Ｎ６维生素、Ｌ－脯氨酸、Ｌ－谷氨酰胺、２，４－二氯苯氧基乙酸（２，４－Ｄ）和脱落酸（ＡＢＡ），使子叶节区内或周围的胚芽膨胀并形成愈伤组织（ＳＣＰＣ），其中所述高粱外植体是切开的具胚子叶；（ｂ）在第二培养基中培养ＳＣＰＣ，所述第二培养基包括ＭＳ矿物盐、Ｂ５维生素、Ｌ－脯氨酸、Ｌ－谷氨酰胺、Ｌ－甘氨酸、脱落酸、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、聚乙烯聚吡咯烷酮（ＰＶＰＰ）、ＡｇＮＯ３和２，４－Ｄ，以诱导茎叶芽；（ｃ）在第三培养基中培养具有诱导茎叶芽的组织，所述第三培养基包括ＭＳ矿物盐、Ｂ５维生素、Ｌ－谷氨酰胺、Ｌ－甘氨酸、ＰＶＰ、硫酸腺嘌呤（ＡｄＳＯ４）、干酪素水解物（ＣＨ）、２，４－Ｄ、６－苄基氨基嘌呤（ＢＡ）和激动素，以增强茎叶芽增殖和生长；（ｄ）在第四培养基中培养具有增殖中的茎叶芽的组织，所述第四培养基包括ＭＳ矿物盐、Ｂ５维生素、Ｌ－甘氨酸、ＡｄＳＯ４、ＢＡ和赤霉酸（ＧＡ３），以增强茎叶生长；（ｅ）在第五培养基中培养具有生长中的茎叶的组织，所述第五培养基包括ＭＳ矿物盐、Ｂ５维生素、Ｌ－甘氨酸、ＰＶＰ、ＡｄＳＯ４、ＢＡ和ＧＡ３，以进一步增强茎叶生长；（ｆ）在第六培养基中培养具有生长中的茎叶的组织，所述第六培养基包括ＭＳ矿物盐、Ｂ５维生素、Ｌ－甘氨酸、ＰＶＰ、ＡｄＳＯ４和吲哚－３－乙酸（ＩＡＡ），以诱导生根。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：R·A·瓦苏德万，K·纳丁穆图，S·拉马钱德兰，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：SG