慢性炎症动物模型的构建方法技术

本发明专利技术属于医疗评价、检测技术和实验动物学领域，具体涉及一种用于筛选治疗慢性炎症药物、评价治疗全身性慢性炎症方法的大鼠动物模型的方法，步骤为：取健康雄性SD大鼠，每周首日尾静脉注射脂多糖，连续4～8周，剂量为120～300μg/kg体重，从而形成外周血白细胞计数与中性粒细胞比例及血清超敏C反应蛋白水平升高，且心脏、肝脏、肺脏、肾脏组织以炎性细胞浸润、组织瘀血水肿为主的病理变化，符合慢性炎症病理特点。本发明专利技术重复性好，操作方法简单、易控、机理明了，指标可定量分析，便于统计学处理，且建立的动物模型更理想、更符合该类疾病的临床病理生理学变化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医疗评价、检测技术和实验动物
，特别地，涉及一种慢性炎症的动物模型的建立方法。
技术介绍
炎症是最重要的基本病理过程之一，各种炎症性疾病在人类疾病谱中占据极为重要的地位。典型的炎症性疾病，如慢性支气管炎等，时至今日仍然是严重困扰极大数人群的常见疾病。不仅如此，近年来的研究表明，许多原本认为与炎症无关或关系不大的疾病事实上也与炎症密切相关。在与心血管疾病、糖尿病一样对预期寿命构成严重威胁的恶性肿瘤的发病机制中，炎症也是一个普遍而重要的因素。基于与上述研究发现相似的、仍在不断增加的证据，抑制炎症成为阻止许多疾病发生以及治疗众多炎症性疾病的关键。直到今天，各类病原体感染仍然是炎症性疾病最主要的原因之一。业已证实，G—菌外膜的脂多糖(LPQ是介导感染性炎症损伤的最主要的病原分子之一，尤其是在G—菌感染隐然跃居各类感染性疾病首位的今日更是如此。由于肠道是人体最大的细菌和LPS库，在严重创伤、烧伤、休克和主要脏器功能衰竭等病理情况下，肠粘膜屏障功能减弱，肠道内的细菌和LPS可进入循环系统，因此，初始疾病为非感染性疾病的患者仍然可能面临LPS导致的严重的炎症损伤，如多器官功能障碍综合征、败血症等就是如此。此外，传统上认为与细菌感染关系并不密切的疾病(例如大部分心血管疾病)以及许多免疫性疾病，已经被发现与某些病原体的慢性感染导致的持续性亚临床炎症损伤密切相关，由此推测抗炎治疗也能够阻止/抑制这些疾病的发生、发展，然而目前已有的抗炎药物在安全性与有效性方面不能满足临床需要，因而产生了开发适用于预防这类疾病的抗炎药物的迫切需求。LPS的生物学活性非常复杂，由于菌种来源、培养和提纯方法以及测试方法不同， 所报道的LPS活性指标也不一致，特别是在机体内的表现形式更是错综复杂。将纯化的LPS 注入易感动物体内可引起多种生物学活性变化，其生物学活性的核心表现与LPS诱导的炎症免疫效应密切相关，其主要的炎症免疫效应有致热、激活补体系统、促进凝血、激活白细胞、致微循环障碍和糖、脂肪代谢紊乱等。尽管已经进行了多年研究，对LPS诱导的炎症损伤的病理生理机制的认识也已经深入至分子水平，然而迄今为止在临床实践中尚无安全、有效的特效应对措施。对于更为多见的LPS诱导的慢性炎症相关疾病，如慢性呼吸道感染等，目前并没有实际可用的拮抗炎症的药物，在由此而导致的全身性炎症损伤的长期作用下，局部的疾病最终对整个机体造成了广泛的不利影响，全身炎症反应的存在也是其他常见的慢性疾病如慢性心力衰竭、肥胖、糖尿病甚至老龄化的重要原因。因此，临床实践迫切需要能够安全、有效地拮抗全身性炎症的药物。鉴于慢性炎症网络的复杂性，如果仅仅干预某个与炎症相关的通路，其效果也许不是最理想的，因此需要以慢性炎症动物模型为平台进行更为广泛而深入的研究，努力寻找能够提高治疗效果的药物作用机制与靶标。由于LPS对机体具有确定的诱导炎症免疫效应，并且对其致炎效应的主要机制已有较多了解，因而LPS已被更广泛用于建立各种炎症相关疾病的动物模型。在以LPS建立的各种炎症模型中，LPS致急性肺损伤模型最为常见，多采用以LPS经腹腔或血管注射的方式，几乎均为单次注射且剂量通常较大(可达5mg/kg至10mg/kg)，造成严重的肺组织急性损伤，常因伴有多器官功能障碍、弥漫性血管内凝血、休克等并发症而导致动物死亡， 显然不能成为研究慢性炎症的动物模型方法。LPS致慢性炎症的动物模型亦有报道，包括眼葡萄膜炎、中耳炎、慢性支气管炎、支气管哮喘等，采用的多是经腹腔或血管注射、局部滴注、吸入，单次或多次干预的方式。事实上，上述剂量级别的LPS进入动物体内并且弥散之后，引发的已经不仅仅是局部的炎症了，更多的是系统性的或者是全身性的炎症了，至少可以确定在经血管注射LPS后引起了慢性炎症。因此，无论是从理论上而言还是参考已被实践证实的先例，经血管注射LPS建立慢性炎症动物模型是可行的。在建模所用剂量降低至 0. 5mg/kg至;3mg/kg不等之后，LPS引发的炎症反应依然剧烈，随着时间延长，动物死亡依然存在，影响了实验研究的进行，对于只需轻中度慢性炎症的实验研究而言无疑是不利的。如欲避免动物死亡而减少实验动物消耗、增强LPS相关慢性炎症实验研究的可控性，降低建模所用LPS的剂量、分次干预可能是可行的方法，但具体降低至多少且仍能获得较为典型的慢性炎症改变，则没有先例可循。
技术实现思路
本专利技术的技术方案提供了一种啮齿类动物慢性炎症模型，它首次尝试利用间断静脉注射LPS来诱导慢性炎症大鼠模型。通过该方法制得的动物模型稳定性好，更接近人类感染性炎症损伤的变化，用于筛选治疗慢性炎症的药物和评价治疗全身性慢性炎症有非常实用的价值。本专利技术的慢性炎症动物模型的建立方法，包括以下步骤步骤一、动物准备健康雄性大鼠，SPF级；步骤二、药物准备取大肠杆菌脂多糖，临用前以无菌生理盐水稀释至所需浓度， 混勻；步骤三、制备动物模型取健康雄性大鼠，每周尾静脉注射LPS 120 300 μ g/kg 体重，每次注射时间间隔约为1周，连续4 8周后即制得慢性炎症动物模型。本专利技术的目的是通过以下技术方法来实现的1、建立慢性炎症动物模型；2.炎症因子检测；3.病理评价。附图说明图1各组大鼠心脏常规HE染色病理组织镜检图谱(X 100)图2各组大鼠肝脏常规HE染色病理组织镜检图谱(X 100)图3各组大鼠肺脏常规HE染色病理组织镜检图谱(X 100)图4各组大鼠肾脏常规HE染色病理组织镜检图谱(X 100)具体实施例方式实施例1 1实验动物和主要试剂SPF级健康雄性SD大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(实验动物生产许可证号SCXK (湘)2009-0004)，体重220 MOg。以普通大鼠饲料饲养，饲养环境温度 25士4°C，相对湿度60% 70%。大肠杆菌脂多糖(血清型055:B5，美国Sigma公司)；PBS(北京索莱宝科技有限公司)；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)；瑞氏-吉姆萨复合染液(南京建成科技有限公司)；白细胞稀释液(南京建成科技有限公司)；大鼠hs-CRP ELISA试剂盒(美国R&D公司)2实验方法2. 1实验动物分组与处理SD大鼠32只，以随机数字表法分为4组，每组8只，分别命名为正常对照组、LPS 120 (LPS 120μ g/kg)组、LPS 160 (LPS 160 μ g/kg)组、LPS 200 (LPS 200yg/kg)组。接受LPS处理的各组大鼠在实验开始后每周首日以该组预设的剂量经尾静脉注射LPS，连续4 周。正常组使用等体积(0.5ml/kg)无菌生理盐水以同样方法间断尾静脉注射4周。2. 2实验动物标本采集实验第4周末，各组大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉穿刺取血5ml。其中Iml用于外周血白细胞计数与分类，其余室温静置后于4°C、4000转/分离心获得血清，分装冻存于-70°C供酶联免疫吸附法检测血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)随后摘取心、 肝、肺、肾并置于10%中性甲醛溶液中固定供常规石蜡切片苏木素-伊红染色(HE染色)病理组织镜检。2. 3主要观察指标与检测方法2.3. 1大鼠存活情况在实验持续期间，即从开始进行尾静脉注射至实验第4周末为止，观察各组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．低剂量的脂多糖在制备用于筛选治疗慢性炎症药物的动物模型中的用途，其中脂多糖的使用方法和剂量为：间断静脉给药，每次剂量为１２０～３００μｇ／ｋｇ体重。

【技术特征摘要】
1.低剂量的脂多糖在制备用于筛选治疗慢性炎症药物的动物模型中的用途，其中脂多糖的使用方法和剂量为间断静脉给药，每次剂量为120 300μ g/kg体重。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于脂多糖的使用剂量为每次120 300 μ g/kg 体重。3.一种制备权利要求1所述的慢性炎症动物模型的方法，其特征在于将啮齿类动物给予脂多糖诱导慢性炎症的产生，建立了动物慢性炎症的疾病模型，其中脂多糖的使用方法和剂量为间断静脉给药，每次剂量为120 300 μ g/kg体重。4.根据权利要求3所述的慢性炎症...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓家刚，卫智权，阎莉，包传红，冯旭，
申请(专利权)人：广西中医学院，
类型：发明
国别省市：45