一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法技术

本发明专利技术涉及快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，首先对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化和制备糖链磁性微粒复合物；再将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合；再将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱；最后对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，以获得甲型流感病毒宿主特异性结果，判断出流感病毒是否感染人。解决常规检测流感病毒手段和检测病毒核酸的方法不能完全评估甲型流感病毒病原的变异和宿主的特异性的技术问题。具有快速、简便、效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及甲型流感病毒领域，具体涉及一种评估甲型流感病毒宿主特异性的方法。
技术介绍
甲型流感病毒为常见流感病毒，并容易发生变异。禽流感病毒为甲型流感病毒的一种亚型，禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，也能感染人类。禽流感病毒不仅严重危害畜牧业的生产，特别是高致病性的H5m禽流感病毒已经跨越种属屏障直接引起人类感染并造成感染者死亡。禽流感病毒抗原类型众多，变异频繁，导致高致病性禽流感防控非常困难。因此有必要发展可用于监测和评估禽流感病毒病原的变异和宿主特异性的新技术。在病毒和宿主细胞表面糖链间的相互作用存在种类特异性，如禽流感病毒主要识别和结合存在于禽肠胃道上皮细胞表面的唾液酸(SA) α 2_3Gal (半乳糖)的糖链受体，而人流感病毒主要识别和结合存在于肺及呼吸道上皮细胞表面的SA α 2_6Gal的糖链受体。最初认为，这种受体特异性的差异，造成了禽流感病毒无法在人间传播。但是，近来的研究表明，禽流感的H5W型的一些毒株能直接感染人类，H9N2亚型同样能由禽类直接传染给人，其原因是它们能同时结合这两种糖链受体。与甲型流感病毒结合的细胞受体是位于细胞膜上糖蛋白或糖脂链末端的唾液酸 (SA)。研究表明流感病毒血凝素(HA)蛋白的受体特异性决定了病毒的宿主范围。人流感病毒HA主要识别和结合末端为SA α 2-6半乳糖(Gal)的唾液酸低聚糖受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面，禽流感病毒HA的主要识别和结合末端为SAa 2_3Gal的唾液酸低聚糖受体，其广泛存在于禽肠胃道的上皮细胞表面。由甲型流感病毒引起的禽流感，其病理变化因感染病毒毒株致病性的强弱和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、日龄和并发感染情况及所感染毒株的致病性和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。长期以来，禽流感的诊断一直依赖于病原的分离和鉴定。近年来，国内外已相继建立了禽流感病毒琼脂扩散(AGP)、血凝抑制试验(HI) 神经氨酸酶抑制试验(Ni)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学诊断技术及分子诊断技术(如RT-PCR)，满足了我国禽流感病毒流行病学监测及现地诊断与防制的迫切需要。病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测禽流感病毒方法的对照，但病毒分离培养耗时长，至少需7天，不利于快速诊断，病毒分离的实验条件要求较高，同时有致病性的危险，对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。禽流感病毒在鸡胚培养过程中还可能发生变异。血凝及血凝抑制试验特异性好，但其操作相对繁琐。血清学检查对最后确诊有回顾性诊断价值，一般只能在发病2-3周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。由于禽流感病毒血清型众多，新的变异株不断出现，制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各种免疫接种的情况下，血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术(NAT) 检测禽流感病毒，选择好靶基因和引物及优化反应参数，均可获得高灵敏度和特异性。对于血清型众多的禽流感病毒，不同亚型致病性不同，其宿主分布也不同，故快速、特异地分型在禽流感病毒诊断中显得尤为重要。RT-PCR方法能够获得所有禽流感病毒的已知HA亚型。 上述流感病毒的检测方法中无论是哪一种检测方法，都无法同时对众多型和亚型的流感病毒进行精确的分型。因而有必要寻找一种高效、高通量和快速的流感病毒检测和分型方法。 基因芯片技术的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。目前国内外已有十多篇关于基因芯片技术在流感检测及亚型鉴别上应用的报道。基因芯片方法仅能够获得所有禽流感病毒的已知亚型，并不能完全检测和评估甲型流感病毒病原的变异和宿主的特异性。
技术实现思路
为了解决常规检测禽流感病毒手段和检测病毒核酸的方法不能完全评估甲型流感病毒病原的变异和宿主的特异性的技术问题，本专利技术提供。本专利技术的技术方案如下，包括以下步骤步骤1 对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化；步骤2 制备糖链磁性微粒复合物；步骤3 将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合；步骤4 将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱；步骤5 对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，根据鉴定结果，以评估甲型流感病毒宿主特异性。上述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特殊之处在于所述步骤1中对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化包括以下步骤；1)取甲型流感病毒悬液；2)在甲型流感病毒悬液中加入等体积分析纯乙醚；3)再置于4°C的环境中0. 5-2小时，并每隔IOmin充分振荡一次；4)将步骤3)处理后的甲型流感病毒悬液以2000r/min的速度进行10-20min的离心；5)对离心后的甲型流感病毒悬液进行静止分层，吸取下层甲型流感病毒悬液，并转移至另一离心管中；6)将盛有转移后的下层甲型流感病毒悬液的离心管置于通风环境中，直至该甲型流感病毒悬液中的乙醚彻底挥发；7)将步骤6)处理后的甲型流感病毒悬液置于低于_18°C的环境中保存。上述步骤2中制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤1)取2支离心管，分别放入等量羟基化磁性微粒若干l_15mg ；2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，再用无水乙醇清洗；4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中，以羟基化磁性微粒的量为参照分别加入20-40 μ L/mg的偶联缓冲液；以羟基化磁性微粒的量为参照，再在其中一个离心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的SA α 2-3Gal糖链；另一个离心管以0. 3-0. 75 μ mo l/mg加入的SA α 2_6Gal糖链；6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液以及糖链进行混勻；并进行 2-10小时的振荡反应；得到糖链磁性微粒复合物；7)对得到的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，弃上清；8)并用结合缓冲液清洗磁性分离后的糖链磁性微粒复合物；9)清洗完成后，将糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。上述步骤3中将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合包括以下步骤1)取制备好的上述两种糖链磁性微粒复合物分别放入另外两个离心管中；2)以2mL离心管为例，在每个离心管中分别加入200-1000 μ L结合缓冲液， 20-500 μ L初步纯化甲型流感病毒液和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)对混勻后的溶液进行0. 5-2小时的振荡反应，得到结合有甲型流感病毒血凝素的糖链磁性微粒蛋白复合物。上述步骤4中将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱包括以下步骤1)对得出的糖链磁性微粒蛋白复合物进行磁性分离，弃上清，并用清洗液清洗；2)将清洗后的糖链磁性微粒蛋白复合物加入洗脱液100-1000 μ L ；3)对加入洗脱液的糖链磁性微粒蛋白复合物进行0. l-2h的振荡反应；4)对反应后的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即纯化出的甲型流感病毒液血凝素；5)对纯化出的甲型流感病毒液血凝素置于低于_18°C的环境中保存。上述步骤5中对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定具体是分别将两种不同糖链磁性微粒复合物纯化得到的甲型流感病毒液血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，包括以下步骤：步骤１：对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化；步骤２：制备糖链磁性微粒复合物；步骤３：将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合；步骤４：将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱；步骤５：对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，根据鉴定结果，以评估甲型流感病毒宿主特异性。

【技术特征摘要】
1.一种快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，包括以下步骤 步骤1 对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化；步骤2 制备糖链磁性微粒复合物；步骤3 将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合； 步骤4 将与糖链磁性微粒复合物结合的甲型流感病毒血凝素进行洗脱； 步骤5 对洗脱后的甲型流感病毒血凝素进行鉴定，根据鉴定结果，以评估甲型流感病毒宿主特异性。2.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于 所述步骤1中对甲型流感病毒血凝素进行初步纯化包括以下步骤；1)取甲型流感病毒悬液；2)在甲型流感病毒悬液中加入等体积分析纯乙醚；3)再置于4°C的环境中0.5-2小时，并每隔IOmin充分振荡一次；4)将步骤幻处理后的甲型流感病毒悬液以2000r/min的速度进行10-20min的离心；5)对离心后的甲型流感病毒悬液进行静止分层，吸取下层甲型流感病毒悬液，并转移至另一离心管中；6)将盛有转移后的下层甲型流感病毒悬液的离心管置于通风环境中，直至该甲型流感病毒悬液中的乙醚彻底挥发；7)将步骤6)处理后的甲型流感病毒悬液置于低于_18°C的环境中保存。3.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于 所述步骤2中制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤1)取2支离心管，分别放入等量羟基化磁性微粒若干；2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，再用无水乙醇清洗；4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中，以羟基化磁性微粒的量为参照分别加入20-40 μ L/mg的偶联缓冲液；以羟基化磁性微粒的量为参照，再在其中一个离心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的 SA α 2-3Gal糖链；另一个离心管以0. 3-0. 75ymol/mg加入的SA α 2_6Gal糖链；6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液以及糖链进行混勻；并进行2-10小时的振荡反应；得到糖链磁性微粒复合物；7)对得到的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，弃上清；8)并用结合缓冲液清洗磁性分离后的糖链磁性微粒复合物；9)清洗完成后，将糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。4.根据权利要求1所述的快速评估甲型流感病毒宿主特异性的方法，其特征在于所述步骤3中将初步纯化后的甲型流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物进行结合包括以下步骤1)取制备好的上述两种糖链磁性微粒复合物分别放入另外两个离心管中；2)以2mL离心管为例，在每个离心管中分别加入200-1000μ L结合缓冲液，20-500 μ L 初步纯化甲型流感病毒液和1-10 μ L的苯甲基磺酞氟，并混合均勻；3)对混勻后的溶液进行0. 5-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李铮，孙宇，杜亚蓉，祁会彩，邓炜娜，王秀荣，杨刚龙，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：87