本发明专利技术“应用GCA稳定转染细胞系测定BNP活性”，建立了一种新的脑利钠肽(BNP)生物活性测定方法。GCA是BNP的主要受体，它是一种腺苷酸环化酶前体，被BNP激活后，催化GTP产生cGMP，继而发挥生物学效应。野生293细胞GCA表达水平低，对于BNP反应性弱，本方法是转基因构建BNP受体(GCA)超表达的稳定细胞株293GCAC3，通过检测BNP刺激后293GCAC3分泌到细胞上清中的cGMP的含量变化，来对BNP活性进行定量。具体检测步骤为：细胞铺96孔板，培养16-18小时，加入BNP刺激90分钟，吸取细胞上清用竞争ELISA检测cGMP含量。该方法操作简单，反应灵敏，变异性小，对于BNP的质量控制和临床应用具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物药物活性检测领域，针对脑利钠肽(BNP)的活性测定建立了更加快速、准确的定量方法。
技术介绍
BNP目前的活性测定方法为离体动脉条法，通过记录BNP作用下动脉张力的变化来进行测定其活性。这种方法不仅操作繁琐，而且误差比较大。而基于细胞系的体外活性测定方法操作简便，误差较小，正越来越广泛的应用于生物药物的活性检测。因此，我们希望可以建立一种基于细胞系的活性测定方法。考虑到没有合适的细胞系来进行BNP的活性测定，我们首先通过转基因构建BNP受体(GCA)超表达的稳定细胞株，再建立竞争ELISA法来进行活性检测。GCA是BNP的主要受体，它是一种腺苷酸环化酶前体，被BNP激活后，催化 GTP产生cGMP，继而发挥生物学效应。本方法的原理是通过检测cGMP的含量变化来对BNP 活性进行定量。
技术实现思路
1.专利技术目的目前，BNP的活性测定方法，误差大，操作繁琐，我们需要建立一种更加快速，简便， 准确客观的定量方法，对于该产品的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要意义。2.技术方案本专利技术首先通过基因转染筛选一种BNP强反应性的稳定细胞系，再建立相应的检测方法来对BNP活性进行定量。其技术流程为J93GCAC3细胞株的建立(GCA稳定表达的单克隆细胞株)一测定方法建立(竞争ELISA)。3.有益效果该检测方法的建立有利于脑利钠肽产品的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。通过与现有的离体动脉条法比较，有如下优点(1)从伦理学角度，不需要动物实验；(2)操作简便，不需要进行组织分离等操作；(3)周期短，可以在48小时内完成全部实验；(4)结果较客观可靠，准确度高，变异小。附图说明图1-1293瞬时转染NPR1/GCA前后的BNP反应性比较Samplel 转染 NPR1/GCA 前的 293 细胞Sample2 转染 NPR1/GCA 后的 293 细胞图1-2^3GCA多克隆稳定细胞株的BNP反应性图1-3-1四个^3GCA单克隆细胞株与多克隆细胞株的BNP反应性比较Samplel :293GCA 多克隆细胞株；Sample2 :293GCA Clone 1Sample3 :293GCA Clone 2Sample4 :293GCA Clone 3Sample4 :293GCA Clone 4图 l-3_2western blot 检测 ^3GCAC3 的 GCA 表达情况A =GCA 抗体 B =DDK 抗体图2-1不同稀释度HRP-cGMP (50ul细胞上清+50ulHRP_cGMP)的实验结果Sample2 1 10000Sample3 1 5000Samp le4 1 1000Sample5 1 500图2_2cGMP—抗分别以1 5000和1 2500包被酶标板的实验结果比较Samplel :cGMP —抗 1 2500 包被Sample2 :cGMP —抗 1 5000 包被图2-3不同细胞密度的实验结果比较Samplel :0. 9X IO4 个细胞 / 孔Sample2 :1·8Χ104 个细胞 / 孑LSample3 :2. 7Χ104 个细胞 / 孑L图2-4不同体积的细胞上清与50ulHRP_cGMP(l 1000稀释)的实验结果Samplel 细胞上清 50ul Sample2 细胞上清 40ulSample3 细胞上清 30ul Sample4 细胞上清 20ul 图2-5三次标定BNP参考品的结果图3NPR1/GCA载体图谱SgfI和MluI两个酶切位点间插入NPR1/GCA cDNA序列。具体实施例方式1.材料与方法1. 1研究对象B型脑利钠肽(BNP)1. 2NPR1/GCA质粒基因ID为匪000906，购买于傲锐东源基因有限公司，载体图谱见图3。HEK293细胞中国食品与药品研究检定院细胞室保存。BNP参考品中国食品与药品研究检定院重组技术产品室制备。1. 3 试剂生长培养基DMEM(GIBC0，#11995)+10% 胎牛血清(GIBC0，#10099)+1 % 双抗 (GIBC0, #15240)平板培养基:DMEM(GIBC0,#11995)脂质体2000 invitrogen, #11668G418 =CalBiochem, #345810G418选择培养基生长培养基+200ug/ml G418BNP稀释液PBS+0. 2%BSA(Merck Calbiochem, #12659)+ImM IBMX (sigma，15879， 临用前加入)cGMP 检测试剂盒cell signaling，#4360ScGMP 一抗=Abcam, ab836一抗包被液碳酸钠0. 32g，碳酸氢钠0. 586g，定容至200ml，PH9. 6HRP-cGMP =Genscript, MO1058HRP-cGMP 稀释液PBS+0. 01% BSA洗液PBS+1%Tween-20TMD Amresco, J644TMD终止液2M硫酸NPR1/GCA 抗体Santa cruz, sc-137041DDK 抗体0riGene，TA5OOll1. 4 仪器酶标仪，Molecular Devices1. 5数据分析软件SoftMax Pro软件，四参数方程1. 6实验流程1. 6. 1293GCA稳定细胞系构建1.6. 1. 1瞬时转染及检测(1)提前16_24h，6孔板铺293细胞，使转染时密度达90%左右；(2)脂质体2000常规转染NPR1/GCA质粒；(3)转染后48h，消化计数，平板培养基重悬，调整细胞浓度至1 X 105/ML, ISOul/ 孔接种至96孔板内，同时将未转染的HEK293以同样的细胞密度接种至96孔板内，共同培养 16-18h ；(4)取1支BNP参考品，用ImlBNP稀释液溶解后，预稀释5倍，再进行4X倍比稀释，20ul/孔加入细胞培养板中；(5)作用90分钟后，取细胞上清50ul按照cGMP检测试剂盒说明书中的步骤检测 cGMP含量变化，结果见图1-1。1. 6. 1. 2稳定转染及多克隆细胞检测(1)转染步骤同瞬时转染；(2)转染后48h，更换G418选择培养基，筛选3周左右，每3_4天更换一次G418选择培养基；(3)待克隆长出后，挑出6个单克隆分别培养，剩余细胞传代，按1. 6. 1. 1种检测方法进行检测，结果见图1-2。1. 6. 1. 3单克隆细胞培养及检测(1)6个单克隆细胞株培养2周左右，其中4个成为稳定克隆。(2)对4个单克隆细胞株的BNP反应性进行检测，结果见图1_3_1 ；(3)经比较3号克隆的反应性较好，分别用GCA抗体和标签(DDK)抗体对其进行 western blot检测，结果见图1-3-2。1. 6. 2BNP活性测定方法建立1. 6. 2. 1比较使用不同稀释度HRP-cGMP的实验结果(见图2_1)。以cGMP —抗1 5000包被酶标板，取细胞上清50ul与HRP-cGMP工作液50ul， HRP-cGMP工作液共设置4个不同的稀释度，分别为1 10000，1 5000,1 1000,1 500。 初步确定为在HRP-cGMP 1 1000稀释度下，结果较好本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽（ＢＮＰ）生物活性的方法，其特征在于：根据ＢＮＰ及其受体的作用机制，构建ＢＮＰ反应性转基因细胞株。
【技术特征摘要】
1.一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽(BNP)生物活性的方法，其特征在于根据 BNP及其受体的作用机制，构建BNP反应性转基因细胞株。2.根据权利要求1的转基因细胞株，其特征在于转染了NPR1/GCA质粒(基因ID为 NM_000906，购买于傲锐东源基因有限公司)，通过加压筛选，获得BNP受体GCA超表达的稳定细胞株，并用于BNP活性检测。3.一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽(BNP)生物活性的方法，其特征在于通过检测BNP刺激下cGMP含量变化对BNP活性进行定量。4.根据权利要求3的技术...
【专利技术属性】
技术研发人员：王军志，饶春明，于雷，高凯，史新昌，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：11
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