疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种新的单纯疱疹（ＨＳＶ）疫苗制剂。该制剂包括ＨＳＶ糖蛋白ｇＤ或与３脱酰单磷酰基酯Ａ结合的免疫学片段。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一类新的疫苗制剂，制备该类制剂的方法及其在治疗中的应用。具体讲，本专利技术涉及一类新的治疗单纯疱疹病毒感染的制剂，更具体说来涉及治疗单纯疱疹病毒2(HSV-2)感染的制剂。HSV-2是生殖器疱疹的原发病原学体，HSV-2和HSV-1(疱疹成因体，单纯疱疹病毒)的特点在于主要在神经元神经节细胞中诱发急性病又会导致隐性感染。据估计，仅仅在美国大约有5百万人患有生殖疱疹，每年临床记录病例有50万(原发和复发性感染)，原发感染主要发生在青春期后，其特点在于局部出现皮肤疼痛损伤，持续2-3周。在原发性感染后的六个月后，有50％的患者仍会复发这种病。其中25％左右的患者每年将会复发10-15次。免疫损害的患者中，据统计高复发率要比一般的患者高。HSV-1和HSV-2病毒均在表面具有许多糖蛋白成分，这些成分称为gA、gB、gC、gD、gE等。糖蛋白D位于该病毒膜上，在感染细胞胞桨中也发现有(Eisen-berg R.J.等人；J of Virol 1980 35 428-435)。gD包含信号肽在内的393个氨基酸，其分子量约为60kD。在所有HSV包膜糖蛋白中，这可能是其最好的特性(Cohen等人，J.Virology 60 157-166)。在体内据说这对于病毒附着于细胞膜上起着重要作用。而且，业已证明糖蛋白D也能在体内诱发中和抗体(Eing等人，J.Med.Virology 12759-65)。然而，仅管在患者血清中中和抗体的效价高，但隐性HSV-2病毒仍能被再激活并诱导所说疾病复发。仅仅具有诱导中和抗体的能力还不足以控制这类疾病，为了防止这类疾病的复发，对于任何疫苗来说，不仅需其刺激中和抗体，而且还要能刺激通过T-细胞介导的细胞免疫。本专利技术的方法能实现这些目的。本专利技术提供的疫苗包括与3-O-脱酰单磷酰基脂A(3D-MPL)(一种单磷酰脂A的脱酰衍生物)及适宜的载体混合的HSV糖蛋白D或其免疫学片段。一般而言，该糖蛋白D来源于HSV-2。所说载体可以是水包油型乳液或明矾，所说3D-MPL的量(每剂)为10μg～100μg，优选25μg～50μg，其中所说抗原一般每剂为2～50μg。可根据英国专利(2220211号)(R1B1)中披露的方法制备3D-MPL。本专利技术的实施方案中，使用截短的308个氨基酸的HSV-2糖蛋白D，该糖蛋白D包括1-306天然存在的糖蛋白的氨基酸和外加在截短的无膜固着区蛋白的C末端的天门冬酰胺和谷氨酰胺。此种形式的蛋白质包括能被分裂产生成熟的283个氨基酸蛋白的信号肽。Genentech的Ep-B-139，417中已对在中国仓鼠卵细胞中产生的这种蛋白质作了介绍。优先选用该成熟的断片制备本专利技术的疫苗制剂，该断片称作rgD2t。可用化学或其他方法将HSV抗原与粒状载体结合，最优选的办法是通过化学方法借助位于肝炎B表面抗原表面上的游离巯基与粒状肝炎B表面抗原结合，参见中请待批的U.K9027623.9号申请。本专利技术的制剂在诱导保护性免疫方面，甚至在抗原剂量非常低(例如低至5μg rgD2t)时也是非常有效的。本专利技术的制剂在使之免遭原发性感染和刺激方面效果特别优异，无论对于特异性体液(中和抗体)还是对于效应基因细胞介导(DTH)免疫应答方面均是如此。水包油型的无毒乳液优选含无毒油(如角鲨烷或角鲨烯)、吐温80这类乳化剂，载体水。所说载体水例如磷酸盐缓冲盐水。本专利技术还提供一种如其中所说的用于医药治疗，特别用于治疗或预防HSV感染的疫苗制剂。本专利技术的疫苗包括免疫保护量的HSVgD或其免疫学片段，该疫苗可用惯常方法制备。在Voller等人编辑的“New Trends and Developments invaccines”(University park press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978)中概括性地披露了疫苗的制备方法。Fullerton的US 4,235,877号专利中介绍了脂质体胶囊。Likhite的US 4,372,945和Armor等人的US 4,474,757号专利中披露了蛋白与大分子的结合。每剂疫苗中蛋白的量是按下述原则选定的，即能诱导免疫保护应答，但对接受免疫剂的对象无明显的付作用。该量随所用的特殊免疫原而异。一般而言，每剂疫苗包括1-1000μg蛋白，优选2-100μg，最优选4-40μg。对具体疫苗的适宜的蛋白量是在进行许多标准的研究基础上确定的，这些研究包括观察受治疗者抗体效价和其他应答。首次免疫接种后，约4周后受治疗者可接受加强免疫。除对易受HSV感染的人接种外，本专利技术的药物组合物还可用于对HSV感染的患者进行免疫治疗。本专利技术还提供了一种下面将予介绍的制备方法，所说方法包括将HSV-2糖蛋白D或免疫片段与载体(如水包油型乳液或明矾)和3D-MPL进行混合。重组单纯疱疹病毒糖蛋白D亚单位疫苗佐药效力的比较在此研究中，用豚鼠模型来评价几种佐剂对改善重组糖蛋白D保护性免疫免遭单纯疱疹病毒HSV-2(rgD2t)感染的能力。实验的佐剂有氢氧化铝、氢氧化铝和3-脱酰-单磷酰基脂A的混合物及水包油型乳液中得到的3-脱酰-单磷酰基脂A。1.抗原HSV rgD2t是转染的中国田鼠卵巢(CHO)细胞中产生的截断的糖蛋白遗传工程重组体(Ep0139417)2.抗原佐剂的制剂和免疫接种程序表为了评价几种rgD2t制剂的保护性免疫，用豚鼠模型进行了二次实验，在第一次实验中，用按如下方法制备的含低剂量抗原(5μg rgD2t)4种佐剂制剂对几组豚鼠免疫接种三次。在最后免疫接种后两周，阴道内用HSV-2病毒对实验组予以攻击，并每天对原发和复发HSV-2病的发展进行监测。在第二次实验中，以较大规模动物组对这些制剂进行评价。也对诸如抗原剂量和佐剂成分这些影响所说制剂效率的因素进行了实验。2.1抗原佐剂制剂第一次实验中用下面的佐剂制剂对豚鼠进行免疫接种，每剂给药剂量为5μg(0.25ml体积)。2.1.1 rgD2t/明矾(氢氧化铝)明矾是从Superfos(Alhydrogel，(Boehimte)Superfos，Demmark)得到的。于4℃下，将5μg经纯化的rgD2t吸附(过夜)子氢氧化铝(明矾)上，该氢氧化铝相等于0.25mg当量Al3+，于0.25mlNaCl(150mM)、磷酸盐(10mM)缓冲液(pH6.8)中。2.1.2 rgD2t/氢氧化铝和3D-MPL3D-MPL是从Ribi Immunochem Research.Inc得到的。按上述2.1.1方法，将5μg gD2t吸附(过夜)于明矾上后，对佐剂制剂进行离心分离，除去上层清液，然后将含100μg 3D-MPL的等体积吸附缓冲液加到该与明矾结合的rgD2t中。对这些rgD2t/明矾制剂而言，均发现98％以上的rgD2t与氢氧化铝佐剂结合。2.1.3 水包油型乳液中(R)的rgD2t/3D-MPL将12％(重量/体积)卵磷脂加到角鲨烯油和0.08％吐温80中以制备所说水包油型乳液。以浓度比最终的希望的高于100倍的条件下加入3D-MPL。然后将1％的该制剂(0.25ml体积)与水相中的5μgrgD2t混合，产生含100μg 3D-MPL的1％的水包油乳液。在第二次实验中，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＨＳＶ糖蛋白ｇＤ或其免疫学片段与３－脱酰单磷酰基脂Ａ的混合物在制备用于预防或治疗ＨＳＶ感染的药物中的应用。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M弗朗科特，JP普里尔斯，M施劳维，NMJC加尔松约翰逊，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]