本发明专利技术涉及包含生物活性物质和甲硫氨酸的一次性使用及多剂量药用配方，其中所述的制剂稳定性增强，且其中所述的制剂不含有人血清白蛋白。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
L－甲硫氨酸在无hsa的制剂中用作nesp/epo的稳定剂的制作方法
技术介绍
由于近来遗传学和细胞工程技术的发展，在体内具有各种药理活性的蛋白质已经能够大批量生产，用作药物。这样的蛋白质包括红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素(α、β、γ、共有序列)、肿瘤坏死因子结合蛋白(TNFbp)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、脑源神经营养因子(BDNF)、角化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、破骨细胞形成阻碍因子(OPG)、胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、肥胖蛋白(OB蛋白)和新的血红素形成刺激蛋白(NESP)。EPO是红细胞系的远祖细胞向红细胞成熟的过程中所必需的糖蛋白类激素。它由肾脏产生，对于调节循环中的血红细胞水平至关重要。以低水平氧信号为标志的条件能够增加EPO的产生，进而刺激红细胞形成。举例来说，慢性肾衰(CRF)中肾功能丧失，常常导致EPO生成减少并同时伴有血红细胞减少。Miyake et al.，J.Biol.Chem.，2525558(1977)从再生障碍性贫血病人中纯化了人尿EPO。但是，这种来源获得的纯化EPO蛋白不足以用作药物。Lin的美国专利No.4,703,008中公开了鉴定和克隆编码人EPO的基因及表达重组蛋白的方法，该专利技术的内容在此引用作为参考。Lai等美国专利No.4,703,008中公开了从细胞培养基中纯化重组蛋白的方法，该专利技术的内容在此引用作为参考。具有生物活性的EPO在哺乳动物宿主细胞中的生成首次使EPO的产量适合于药用。另外，基因序列的获知和纯化蛋白质的更容易获得使人们对这种蛋白质的作用模式有了更深入的认识。人尿来源的EPO(Miyake et al.，同上)和哺乳动物细胞中表达的重组人EPO都含有三个N-连接和一个O-连接的寡聚糖链，共占糖蛋白总分子量的40％。N-连接糖基化发生在24、38和83位的精氨酸残基上，而O-连接糖基化发生在126位的丝氨酸残基上(参见Lai et al.，J.Biol.Chem.，2613116(1986)；Broudy et al.，Arch.Biochem.Biophys，265329(1988))。末端唾液酸残基能够对寡聚糖链进行修饰。典型地说，每个N-连接糖链可具有4个唾液酸，每个O-连接糖链可具有2个唾液酸。一条EPO多肽链最多可以容纳共14个唾液酸。许多研究都已表明改变EPO糖链影响其生物活性。在一项研究中，通过诱变精氨酸或丝氨酸残基这两个糖基化位点，单独或同时去除N-连接或O-连接糖链明显降低了哺乳动物细胞中产生的突变EPO的体外活性；Dube et.Al.，J.Biol.Chem.，26317516(1988)。但是，据DeLorme et al.，Biochemistry，319871-9876(1992)报道，去除EPO中的N-连接糖基化位点降低其体内生物活性，而不会降低其体外生物活性。通过测定分离的EPO同工蛋白的体内活性，揭示了EPO中唾液酸含量和其体内生物活性之间的关系。通过测定等摩尔浓度的分离EPO同工蛋白使正常小鼠红细胞压积的增加量，以此反应EPO的体内生物活性。结果发现随着每个EPO分子中唾液酸的含量逐步增加，其体内生物活性也逐步增加；Egrie et al.，Glycoconjugate J.，10263(1993)。具有较高唾液酸含量的EPO同工蛋白还表现出较长的血清半衰期，但是与EPO受体的亲和力下降，说明血清半衰期是体内生物活性的一个重要指标。在美国，EPO已经用于治疗处于透析及透析前阶段的慢性肾衰，治疗癌症化疗后的继发性贫血及叠氮胸苷治疗HIV感染后出现的贫血。在全球，EPO已经用于治疗与早、镰状细胞贫血、类风湿性关节炎和骨髓移植等相关的贫血；Markham et al.，Drugs，49232-254(1995)。NESP是超级糖基化的红细胞生成素类似物，和rHuEPO的氨基酸序列相比有5处改变，具有两个额外的糖链。更具体地说，NESP在30和88位氨基酸残基(数字对应于人EPO的序列)之间含有两个额外的N-连接糖链(参见No.US94/02957号PCT申请，在此以整体形式引入作为参考)。NESP具有和EPO不同的生化特征，具有更长的血清半衰期和更高的体内生物活性；Egrie et al.，ASH，Blood，9056a(1997)。NESP在小鼠、大鼠、犬和人体内的血清半衰期增加了约3倍之多。和rHuEPO相比，小鼠中NESP更长的血清半衰期和更高的体内活性使获得相同生物反应性所需要的给药频率降低(每周一次或每隔一周一次)。一项药代动力学研究结果和动物研究结果相一致。在慢性肾衰病人中，和rHuEPO相比，NESP明显具有更长的血清半衰期，说明对于人来说也可以降低给药频率；MacDougall，et al.，J American Societyof Nephrology，8268A(1997)。，给药频率降低使医生和病人更方便，对参与自我给药的病人来说尤其有帮助。给药频率降低的其他优点包括导入病人的药物减少，服用rHuEPO相关的一些副作用的性质或严重程度减小，依从性上升。虽然商品化的EPO和NESP制剂具有良好的耐受性和稳定性，但也要考虑到一个事实，就是在极端条件下，这种蛋白质在生产、操作和保存过程中会变得不稳定，发生各种不希望的理化降解。这些降解包括聚集、失活和甲硫氨酸残基的氧化。一些外来因素会加速这种降低过程，如热、光、制剂中不含白蛋白之类的人血产品或多剂量制剂中含有苯甲醇之类的防腐剂。有文献报道抑制含甲硫氨酸的多肽氧化的方法；Takruri et al.，U.S.Patent No.5,272,135(December 21，1993)。具体地说，Takruri介绍了抑制液体或半液体制剂中甲硫氨酸残基氧化的方法，其中制剂包含氨基酸序列中具有至少一个甲硫氨酸残基的多肽。往制剂中加入游离L-甲硫氨酸，使加入的量足以抑制多肽中甲硫氨酸残基的氧化，实现对甲硫氨酸氧化的抑制。甲硫氨酸残基的氧化与包装及储存制剂的塑料器皿有关，如易于使氧气透过的聚丙烯或低密度聚乙烯(LDPE)。Takruri文献中打算使用的多肽是生长因子，检验的制剂是表皮生长因子(EGF)的眼药水制剂。没有讨论包含EPO或NESP或其他糖基化蛋白的制剂，也没有讨论无HSA、多剂量或无HSA多剂量的制剂。专利技术概述本专利技术提供EPO和/或NESP的药用制剂，其中所述制剂中甲硫氨酸和其他稳定剂的加入使制剂更稳定，即使在极端条件下也是如此，而不加这些成分时光、热、添加剂中的杂质、预先加满的注射器中存在的leacheats、生产过程、保存、运输和操作会诱导关键的降解。重要的是，在关键降解更为明显的无HSA制剂及含防腐剂的无HSA多剂量的制剂中，制剂稳定性也有所提高。附图简述附图说明图1是说明游离甲硫氨酸对暴露在光线下的NESP聚集影响的图。磷酸盐缓冲液中的NESP于室温在紫外光下暴露4小时。图2是说明游离甲硫氨酸对保存在2～8℃、添加有1％苯甲醇的NESP聚集影响的图。含有500μg/mL NESP的样品保存了13个月。图3是说明各种添加剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
包括生物活性物质和甲硫氨酸的药用制剂，其中所述的制剂稳定性得到改进，并且不含人血清白蛋白。
【技术特征摘要】
US 2001-8-30 09/945,5171.包括生物活性物质和甲硫氨酸的药用制剂，其中所述的制剂稳定性得到改进，并且不含人血清白蛋白。2.根据权利要求1的制剂，其中所述的甲硫氨酸的浓度约0.5mM～50mM。3.根据权利要求2的制剂，其中所述的活性物质选自肽、小分子、糖、核酸、脂、蛋白质和相应的类似物。4.根据权利要求3的制剂，其中所述的活性成分是蛋白质。5.根据权利要求4的制剂，其中所述的蛋白质是红细胞生成素(EPO)。6.根据权利要求5的制剂，其中所述的EPO含SEQ ID NO1所述的氨基酸序列。7.根据权利要求6的制剂，还包括使为pH约5至约7的pH缓冲试剂。8.根据权利要求7的制剂，还包括用量具有稳定作用、浓度约0.001％～0.1％的脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物(w/v)。9.根据权利要求4的制剂，其中所述的蛋白质是新的红细胞生成刺激蛋白(NESP)或其化学修饰物。10.根据权利要求9的制剂，其中所述的NESP具有如SEQ IDNO2所述的氨基酸序列。11.根据权利要求10的制剂，还包括使pH约5至约7的pH缓冲试剂。12.根据权利要求11的制剂，还包括用量具有稳定作用、浓度约0.001％～0.1％的脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物(w/v)。13.包括生物活性物质、防腐剂和甲硫氨酸的药用多剂量制剂，其中所述的制剂具有增强的稳定性，并且不有人血清白蛋白。14.根据权利要求13的制剂，其中所述的甲硫...
【专利技术属性】
技术研发人员：T李，BS常，C斯勒伊，
申请(专利权)人：麒麟安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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