L-甲硫氨酸的发酵制造方法技术

本发明专利技术涉及一种适用于发酵制造Ｌ－甲硫氨酸且可由一起始菌株制得的微生物菌株，该微生物菌株的ｙｊｅＨ基因产物的活性或ｙｊｅＨ同系物基因产物的活性与该起始菌株相比是增强的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过发酵制造L-甲硫氨酸的方法。
技术介绍
氨基酸甲硫氨酸在动物饲养方面扮演着极重要的角色。甲硫氨酸是脊椎动物新陈代谢中不能以生物合成方式制造的若干必需氨基酸之一。因此，在动物饲养方面，必须确保饲料内摄入足量的甲硫氨酸。但，传统饲料植物(例如大豆或谷物植物)内的甲硫氨酸含量经常太低(尤其对饲养猪和家禽而言)，为确保最佳动物饲养，动物饲料内最好掺以甲硫氨酸作为添加物。甲硫氨酸对动物饲养的特别重要性亦可归诸于一项事实除L-半胱氨酸(或L-胱氨酸)之外，甲硫氨酸是新陈代谢中的重要硫源。虽然动物新陈代谢可将甲硫氨酸转化成半胱氨酸，但该新陈代谢不能将半胱氨酸转化成甲硫氨酸。在现有技术中，以化学合成法制造的甲硫氨酸，年产量＞100,000吨。在此方法中，首先由丙烯醛与甲基硫醇反应生成3-甲基硫丙醛，继之该3-甲基硫丙醛再与氰化物、氨及一氧化碳反应生成乙内酰脲，该乙内酰脲最后可水解生成一消旋物(两种异构体D-及L-甲硫氨酸的等摩尔混合物)。因该分子的生物活性型仅代表L-型，饲料内所含的D-型者必须通过代谢脱氨作用及氨基转移作用首先转化成活性L-型者。通过将消旋物分开或通过乙内酰脲酶以制造对映体纯L-甲硫氨酸的方法虽然已经公开，但由于其成本高，截至目前为止，该方法尚未应用于动物饲料工业。与甲硫氨酸形成明显对比的是，目前绝大多数其他天然蛋白原氨基酸主要是通过微生物发酵制得。此处，是利用在微生物内以合成该天然氨基酸所用适当生物合成途径的可用性。再者，利用葡萄糖及矿物质盐类等廉价反应物，许多发酵法可将制造成本降至极低且可进一步制得有关具有生物活性的L-型氨基酸。但，野生型菌株内氨基酸的生物合成途径受到严格的代谢控制以确保氨基酸的制造仅是供细胞自己使用。所以，有效制造方法的重要条件是能够获得在制造预期氨基酸方面产量大幅增加(与野生型微生物相比较)的适当微生物。此类超量生产氨基酸的微生物可用传统突变/选择法及/或用新的特异性重组技术(代谢工程)制得。在重组技术中，由于其修饰、激活作用或失活作用，首先将可引起氨基酸超量生产的基因或等位基因加以识别。之后将该基因/等位基因引入一微生物菌株内或利用分子生物学技术将其加以失活，以便可实现最佳超量生产。但，经常仅结合数种不同方法才可实现真正有效生产。在微生物内实施L-甲硫氨酸生物合成非常复杂。该分子的氨基酸本体(amino acid body)是衍生自L-天冬氨酸，该L-天冬氨酸是经由天冬氨酰半醛/天冬氨酰磷酸转化为L-高丝氨酸。继之以三个酶作用步骤，该步骤包括(经由O-琥珀酰高丝氨酸及胱硫醚)用一巯基(该巯基是来自一半胱氨酸分子)替代该分子上的羟基，而形成一高(同型)丝氨酸。在生物合成的最后步骤内，通过将该巯基加以甲基化最后制得L-甲硫氨酸。该甲基是衍生自丝氨酸代谢作用。表面上，就其本身而言，甲硫氨酸是在微生物代谢作用中由天冬氨酸、丝氨酸及半胱氨酸等氨基酸合成，所以需要的生物合成远较其他氨基酸复杂。除主要合成途径(天冬氨酸-高丝氨酸-高半胱氨酸)之外，半胱氨酸生物合成及(因此)无机硫的繁复固定以及Cl代谢作用亦必须加以最佳协调。基于这些理由，过去对L-甲硫氨酸的发酵制造法尚未非常深入地加以研究。但，近年来在丝氨酸及半胱氨酸代谢作用的最适化作用方面业已获得决定性的进步，因此L-甲硫氨酸的发酵制造目前亦显示务实状况。所以，在现有技术中最近亦曾述及朝此方向的初步研究工作。有关，利用下列基因/等位基因可达成L-甲硫氨酸的超量生产，已经现有技术予以公开-如同一专利申请人于2002年10月11日所提专利申请内或日本专利JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。此类metA等位基因编码O-高丝氨酸转琥珀酰酶，该O-高丝氨酸转琥珀酰酶受控于L-甲硫氨酸的减低的反馈抑制作用(reduced feedback inhibition)。如此可导致O-琥珀酰高丝氨酸的产生与细胞内的甲硫氨酸水平的广泛去偶联现象。-如日本专利JP 2000139471A中所述的metJ缺失。metJ基因编码甲硫氨酸代谢作用的中央基因调节子，因此在甲硫氨酸生物合成基因表达的控制方面担任一重要角色。现有技术同样提示确保L-丝氨酸及L-半胱氨酸的合成增加的已知方法对L-甲硫氨酸的制造具有正面影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可使L-甲硫氨酸超量生产的微生物菌株。另一目的是提供一种通过本专利技术的微生物菌株以制造L-甲硫氨酸的方法。前一个目的可通过由一起始菌株制得的、具有(与该起始菌株相比)增强的yjeH基因产物的活性或yjeH同系物基因产物的活性的微生物菌株而实现。依照本专利技术，虽然该基因产物的比活性保持不变，若由于该细胞内基因产物的量增加而使该细胞的总活性增加则yjeH基因产物的活性亦增加，而且每个细胞yjeH基因产物的活性亦增加。在基因组测序过程中经识别大肠杆菌yjeH基因是开放阅读框(布莱特纳等人，1997，科学杂志2771453至1462)并编码一包括418个氨基酸的蛋白质。截至目前为止，尚不能确定该yjeH基因具有何种生理功能。以资料库搜寻具有序列同源性的蛋白质(GCG威斯康辛软件包FASTA演算法，遗传学电脑组(GCG)麦迪逊、威斯康辛)也仅能提供极少线索，这是由于其仅与功能同样未定的蛋白质才具有重要的相似之处。yjeH基因及yjeH基因产物(yjeH蛋白质)的特征是分别具有SEQ ID NO1及SEQ ID NO2的序列。就本专利技术的范围而言，tjeH同系物应理解为序列相同性大于30％(优选大于53％)的基因，利用最佳拟合(BESTFIT)演算法分析(GCG威斯康辛软件包，遗传学电脑组(GCG)麦迪逊，威斯康辛)。特别优选为相同性大于70％的序列。同样地，应该理解的是，yjeH-同源蛋白质是指序列相同性大于30％(优选大于53％)的蛋白质(最佳拟合演算法分析(GCG威斯康辛软件包，遗传学电脑组(GCG麦迪逊，威斯康辛)。特别优选为相同性大于70％的序列。因此，yjeH同系物亦指yjeH基因的等位基因变体，尤其功能性变体，该变体是通过核苷酸的缺失、插入或取代自SEQ ID NO1内所描述的序列衍生者，但该特定基因产物的的活性保持不变。yjeH基因产物活性较起始菌株增强的本专利技术的微生物可利用标准分子生物学技术产生。原则上，具有L-甲硫氨酸生物合成途径、可使用重组物方法及可通过发酵培养的任何微生物均可作为适当的起始菌株。此类微生物可以是真菌、酵母或细菌。优选的细菌是真细菌系统发育群(phylogenetic group of eubacteria)的细菌。特别优选的是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，尤其优选为大肠杆菌。举例而言，通过yjeE基因的增强表达，可实现本专利技术微生物内yjeH基因产物活性的增加。由于适当启动子的作用，此种情形可涉及微生物内该yjeH基因的拷贝数增加及/或该yjeE基因的表达增强。优选地，表达增强是指该yjeH基因的表达强度至少是起始菌株内的两倍。微生物内该yjeH基因的拷贝数可利用本领域人员已知的方法予以增加。因此，举例而言，可将该yjeH基因克隆入每个细胞具有多拷贝的质粒载体内(例如大肠杆菌的pUC19、pBR322、pACYC18本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于发酵制造Ｌ－甲硫氨酸且可由一起始菌株制得的微生物菌株，该微生物菌株的ｙｊｅＨ基因产物的活性或ｙｊｅＨ同系物基因产物的活性与该起始菌株相比是增强的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯迈尔，克里斯托夫温特哈尔特，克斯廷普法伊费尔，
申请(专利权)人：瓦克化学股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]