本发明专利技术涉及一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列，所提供的对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白，其基因序列为序列表中序列1所示的核苷酸序列，其基因序列为SEQ?ID?No：1，其氨基酸序列为序列表中序列2所示的氨基酸序列，其氨基酸序列为SEQ?ID?No：2)。本发明专利技术有益的效果是：根据本发明专利技术的对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列，可以制备出新型的生物抗胃肿瘤药，防治胃肿瘤的危害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，主要是一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列。
技术介绍
随着生活水平的提高，消化道肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，位于恶性肿瘤首位， 亦是全球癌症导致死亡的主要原因，且总体仍处于姑息治疗水平。胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织公布的全球统计报告，世界胃癌年发病率为13.86% /10万人，仅次于肺癌居第二位。我国是胃癌的高发区，每年新发现40万胃癌患者，占世界胃癌发病人数的42%，而且发病率呈年轻化趋势， 近5年来，19岁至35岁青年人胃癌发病率比30年前翻了一番，由上世纪70年代的1. 7% 上升至3. 3%。目前胃癌治疗以手术、放疗和化疗为首选方法。手术的最大优点是快捷了当地切除肿瘤，解决机体当前的致命伤，对局部治疗效果极佳；缺点是对全身治疗与机体防御反应的提高毫无作用。放疗对胃癌的敏感性低、疗效差，加之胃部周围重要脏器多，放射治疗常伤及机体的正常细胞和组织。化疗的优点是全身治疗并且对癌细胞的杀伤力强，对原发的、 残留的、扩散的或转移的肿瘤细胞，均有独到与回生之功，但缺点是毒副作用大，使全身遭受到某种程度的损害。对早期胃癌，手术切除治疗效果较好，但由于胃癌初期常无显著症状，缺乏临床特征，多数患者检查发现时已是较晚期，超出了根治切除范围。化疗往往使患者忍受不了它的副作用，甚至使患者的生存质量日趋恶化，因此，手术切除配合靶向性强的抗肿瘤中药治疗具很大应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决上述现有技术的缺点，提供一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列，一种对胃肿瘤细胞具靶向作用的雷丸蛋白质及其编码的基因序列，雷丸蛋白酶基因工程菌的构建。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案本专利技术所提供的对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白(对胃肿瘤细胞具靶向作用的雷丸蛋白质)，其基因序列为序列表中序列1所示的核苷酸序列(其基因序列为SEQ ID No :1)，命名为 LAtP。所述对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白(对胃肿瘤细胞具靶向作用的雷丸蛋白质)，其氨基酸序列为序列表中序列2所示的氨基酸序列(其氨基酸序列为SEQ ID No 2)，命名为LAtP。由SEQ ID No :1核苷酸碱基序列被其他碱基所取代但氨基酸残基序列不变的蛋白质均在本专利技术保护范围之内。由SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对胃肿瘤细胞具有靶向作用的由(a)衍生的蛋白质均在本专利技术保护范围之内。所述雷丸蛋白对胃肿瘤细胞有特异性作用可由以下方法阐明(1)提取纯化对胃肿瘤细胞有特异作用的雷丸蛋白本专利技术所用提取液15% pH 8.0的lMTris-HCl，2%的聚乙烯吡咯烷酮K30，25% 的甘油。研磨雷丸成粉末，按3. 5mL/克样品加入上述提取液，低温静置4h。离心取上清，以 SephadexG50为介质，以pH8的Tris-HCl盐酸洗脱，检测波长^Onm下收集吸收峰，聚乙二醇(PEG) 20000浓缩主峰。(2)正常胃细胞和胃肿瘤细胞实验以DMEM(含100U · mL—1青霉素和IOOpg · mL—1的链霉素)培养液培养正常胃细胞 MC-I和胃癌细胞MC-4，以RPMI1640 (含100U · mL"1青霉素和IOOpg · mL"1的链霉素)培养液培养胃癌细胞SGC-7901，培养条件均为37°C、5% CO20以相应细胞培养液稀释雷丸蛋白至180μ g/mL、120y g/mL、90y g/mL、60y g/mL 和45μ g/mL，分别加于37°C、5% CO2中培养24h后的3种细胞中，同样条件下培养18h， 0.25%胰酶消化细胞、收集，磷酸缓冲液(PBS)清洗两次，将细胞悬浮于IOOyL binding buffer(Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I,BD Pharmingen公司)中，力口入5μ1 Annexin V FITC及5 μ IPI染色液，轻轻混勻，避光室温孵育15min，加入400 μ L Binding buffer，流式细胞仪检测。所述对胃肿瘤细胞有特异作用的雷丸蛋白的基因序列和体外表达可由以下方法获得(1)雷丸蛋白LAtP的N-端测序按Tricine-SDS-PAGE方法进行电泳，取下凝胶，按电转移操作方法于IOV恒压条件下进行电转移，2. 5小时后取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒后进行以考马期亮蓝R250染色 1分钟，用5%乙酸脱色，并用去离子水充分洗涤，剪下条带送上海基康生物有限公司进行蛋白N端测序，按测序结果设计引物如SEQ ID 3序列所示。(2)雷丸蛋白基因LAtP序列的获得以雷丸总RNAl μ L为模板，按TaKafci RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0试剂盒操作方法逆转录获得雷丸蛋白基因LAtP序列，如SEQ ID 1所示，由所得基因序列翻译成蛋白序列如 SEQ ID2 所示。(3)对胃肿瘤细胞有特异作用的蛋白LAtP体外表达按载体pET-02T (北京百泰威克)操作方法，将基因LAtP与pET_02T连接构建重组质粒，转化至感受态大肠杆菌DH5 α中，以卡那霉素筛选阳性克隆，经测序鉴定，将正确连接的含有完整LAtP蛋白基因的的重组质粒命名为pET-02T/LAtP，将重组工程菌命名为 DH5a /LAtP0按Takara公司质粒抽提试剂盒抽提大肠杆菌DH5 a /LAtP中重组质粒后，通过原生质体方转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，以卡那霉素筛选阳性克隆，得到重组工程菌， 命名为 BL21(DE3)/LAtP。本专利技术有益的效果是根据本专利技术的对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列，可以制备出新型的生物抗胃肿瘤药，防治胃肿瘤的危害。附图说明图1为LAtP蛋白纯化层析2为流式细胞仪检测LAtP对胃癌细胞MC-4作用结果图3为流式细胞仪检测LAtP对胃癌细胞SGC-7901作用结果图4为流式细胞仪检测LAtP对胃细胞MC-I作用结果图5这蛋白质纯化前后电泳6为雷丸蛋白LAtP于大肠杆菌中表达结果图7为重组质粒结构示意图。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，可参考分子克隆第三版， 所用引物序列均由上海生工生物公司合成。雷丸AS5. 158 (Omphalia Iapideacens或 Laccocephalum mylittae)菌种从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买。一般生化试剂购于杭州华东医药集团有限公司，RNAiso Plus、T4DNA连接酶、Takara RNA PCR kit (AMV) ver. 3. O、Taq酶等购于Takara公司。PVDF膜购于Millipore公司。实施例1、雷丸饮片中蛋白质的提取与纯化准确称取Ig雷丸粉末样品加入3.5mL预冷提取液，冰上静置4h后，于 11100rpm4°C下离心20min，取上清液，即为粗提液。以S印hadeXG50为介质进行低效液相层析，最佳分离纯化条件吸收波长= 280nm ；灵敏度 V = 0. 2 ；流速0. 2mL/min ；走本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白，其特征在于：其基因序列为序列表中序列１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宜涛，单乐天，林美爱，王伟剑，刘文洪，程东庆，丁志山，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：86
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