一种HPV多肽疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种ＨＰＶ多肽疫苗及其制备方法，ＨＰＶ多肽疫苗主要由１份ＨＰＶ１６Ｅ７↓［１１－２０］、１份ＨＰＶ１６Ｅ７↓［８６－９３］、１份破伤风类毒素ｔｔ８３０－８４３和１～４份的不完全佐剂ＩＦＡ组成。本发明专利技术的多肽疫苗能刺激人免疫重建荷人ＨＰＶ１６阳性宫颈癌ＳＣＩＤ小鼠体内免疫系统产生免疫应答，并在一定程度上能减轻免疫抑制状态。本发明专利技术的疫苗制备方法操作简单，可以在注射前临时制备。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，特别地，涉及一种宫颈癌治疗性疫苗——HPV多肽疫苗及其制备方法。
技术介绍
宫颈癌的发生率为妇科恶性肿瘤之首，死亡率居妇科恶性肿瘤第二位。即使对低危型的早期病例经理想的初次治疗后，仍有15％的复发率，而对那些复发病例的治疗效果相对较差，因此，医学界一直在寻求新的治疗手段。以免疫治疗为代表的生物治疗已成为肿瘤治疗的第四模式。妇科恶性肿瘤常规疗法即手术、放疗和化疗均是通过外源手段杀伤肿瘤，对晚期患者的痊愈难以奏效，且常有明显的损伤和毒副作用。而肿瘤疫苗通过提高机体免疫识别能力或提高肿瘤抗原的免疫原性和免疫介导的肿瘤杀伤能力，可打破患者的免疫耐受和免疫抑制状态，以内源途径达到治疗或预防的目的。大量流行病学调查发现宫颈癌与HPV(人乳头状瘤病毒)感染密切相关，并以HPV16最为常见，占50％。因此，HPV16成为宫颈癌疫苗的主要靶标。同时研究发现宿主的免疫应答在HPV相关的宫颈疾病发生中有重要作用，为发展针对HPV的免疫治疗提供了急迫性和合理性。HPVE6和E7持续表达于宫颈癌细胞，具有免疫原性，是免疫治疗理想的靶抗原。HPV16 E6和E7原癌蛋白在细胞内降解，其产物多肽能诱发强大的抗肿瘤免疫应答，这些激励了基于多肽疫苗的发展并用以治疗晚期宫颈癌患者，成为疫苗治疗肿瘤的典范。研究和开发HPV的预防性和治疗性疫苗，有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种宫颈癌治疗性疫苗——HPV多肽疫苗及其制备方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一种HPV多肽疫苗，它主要由1份HPV16E711-20，1份HPV16E786-93，1份破伤风类毒素tt830-843和1～4份的不完全佐剂IFA组成。一种HPV多肽疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)多肽合成由多功能多肽合成仪分别一次合成HPV16E711-20、HPV16E786-93和破伤风类毒素tt830-843；(2)疫苗制备将1份HPV16E711-20、1份HPV16E786-93、1份破伤风类毒素tt830-843和1～4份的不完全佐剂IFA制成疫苗。本专利技术相对于现有技术，具有如下技术效果(1)本专利技术的多肽疫苗能刺激人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID小鼠体内免疫系统产生免疫应答，并在一定程度上能减轻免疫抑制状态。(2)本专利技术的疫苗制备方法操作简单，可以在注射前临时制备。具体实施例方式下面结合实施例详细说明本专利技术。其中，HPV16E711-20表示人乳头瘤病毒16型E7蛋白的11-20肽段，tt830-843表示破伤风类毒素的830-843肽段，IFA是弗式不完全佐剂。PBS是磷酸盐缓冲液，hu-PBL是人外周血淋巴细胞，SiHa细胞是人宫颈癌HPV16阳性细胞系，均为本领域普通技术人员熟知的技术特征。实施例11.多肽合成HPV16E711-20序列为YMLDLQPETT，用P1表示；HPV16E786-93序列为TLGIVCPI，用P2表示；P1、P2代表了2个CTL免疫表位。tt830-843序列为QYIKANSKFIGITE，用T表示。P1、P2、RP、T分别由多功能多肽合成仪一次合成，纯度均大于95％。2.疫苗制备临用前配制，多肽治疗组疫苗组成为P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA(50μg)。实施例21.多肽合成与实施例1相同。2.疫苗制备临用前配制，多肽治疗组疫苗组成为P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA(100μg)。实施例31.多肽合成与实施例1相同。2.疫苗制备临用前配制，多肽治疗组疫苗组成为P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA(200μg)。用本专利技术的宫颈癌治疗性疫苗——HPV多肽疫苗接种人免疫重建荷人HPV16阳性宫颈癌SCID鼠模型，观察其对人免疫重建荷SiHa细胞SCID鼠免疫功能的影响1.实验分组无免疫渗漏SCID鼠30只，随机分为4组。第一组6只，每只腹腔注射0.5ml细胞密度为8×107hu-PBL/ml的PBS，疫苗成份仅为IFA，作为空白组；第二组8只，每只腹腔注射0.5ml细胞密度为8×107hu-PBL/ml的PBS，24小时后每只皮下接种左右腋窝和背部，共3点，每点接种0.2ml细胞密度为5×107SiHa细胞/ml的PBS，疫苗成份为RP+T+IFA，作为随机多肽组，其中，RP表示HPV16E712-20，序列为MLDLQPETT，；第三组8只，每只腹腔注射0.5ml细胞密度为8×107hu-PBL/ml的PBS，进行免疫重建，24小时后皮下接种SiHa细胞，方法同第二组，疫苗成份为T+IFA，作为T辅助多肽组；第四组8只，每只腹腔注射0.5ml细胞密度为8×107hu-PBL/ml的PBS，进行免疫重建，24小时后皮下接种SiHa细胞，方法同第二组，疫苗成份为作P1+P2+T+IFA，作为多肽治疗组。2.疫苗制备临用前配制，多肽治疗组疫苗组成为P1(50μg)+P2(50μg)+T(50μg)+IFA，随机多肽组为RP(50μg)+T(50μg)+IFA，T辅助多肽组为T(50μg)+IFA，空白组为IFA。3.接种疫苗当肿瘤体积约为100mm3时，三次于背部皮下接种疫苗，每次接种间隔二周。当肿瘤体积约为1000mm3时处死SCID鼠，第二、三、四组分别随机留3只观察自然生存时间。4.生物学特性观察荷瘤鼠一般特征观察每天观察精神状态、活动力、反应、饮食、体重、毛色、毛顺滑度及背部和腹部瘤组织的生长情况。大体检查荷瘤第105天处死SCID鼠解剖，观察移植瘤形态、直径、质地、活动度及脏器转移等情况。组织学观察移植瘤及肝、脾、肺、肾、子宫、附件、大网膜等各脏器经10％福尔马林固定，石蜡包埋、切片、HE染色、镜检。5.免疫学特性检测 5.1鼠血浆人IgG测定各组每2周断尾取血100μl，采血6次连同第105天处死共7次，采用磁酶免法测定人IgG含量。5.2流式细胞测定CD3+、CD4+、CD8+T细胞眼球取血的SCID鼠的外周血，淋巴细胞分离液常规分离后的淋巴细胞，用流式细胞试剂盒检测CD3、CD4、CD8阳性T细胞数。5.3脾重处死后各组小鼠解剖取脾称重。5.4免疫组化检测脾和肿瘤组织中人CD8+T细胞取各组鼠脾脏和皮下移植瘤组织，以SP免疫组化染色检测人CD8+T细胞。5.5脾细胞毒杀伤功能(CTL)测定用乳酸脱氢酶(LDH)释放法。将培养24-48小时的K562细胞(1×104/孔)置于96孔板内；每组中检测免疫学指标的小鼠，在第105天摘眼球处死取脾，制成脾单细胞悬液，按效靶比例(E∶T)50∶1，100∶1加样于96孔板中，每份标本设2复孔，设自然释放对照(加入PBS100μl)及最大释放对照(加入1％NP-40100μl)，37℃，5％CO2孵育4小时，吸取上清100μl，加入另一培养板中，37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的底物溶液(NBT 4mg，NAD+10mg，PMS1mg，加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上液1.6ml加1mol/l乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/lpH7.4的磷酸缓冲液至10ml)0.1ml，室温避光15min，每孔加入1mol/L柠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＨＰＶ多肽疫苗，其特征在于，它主要由１份ＨＰＶ１６Ｅ７↓［１１－２０］，１份ＨＰＶ１６Ｅ７↓［８６－９３］，１份破伤风类毒素ｔｔ↓［８３０－８４３］和１～４份的不完全佐剂ＩＦＡ组成。

【技术特征摘要】
1.一种HPV多肽疫苗，其特征在于，它主要由1份HPV16E711-20，1份HPV16E786-93，1份破伤风类毒素tt830-843和1～4份的不完全佐剂IFA组成。2.一种权利要求1所述的HPV多肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)多肽合成由...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢幸，叶枫，吕卫国，梁朝霞，陈怀增，周坚红，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]