本发明专利技术涉及二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，其剂型为冻干注射剂及水针剂，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种狂犬病纯化疫苗，特别是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗。
技术介绍
目前世界大量生产的狂犬疫苗有四种第一种以美国为代表的二倍体细胞，经过浓缩超离制备的狂犬疫苗；第二种以法国为代表的Vero细胞为培养基质的，生产冻干灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致瘤和细胞的DNA。第三种和第四种以中国为代表的地鼠肾和日本的鸡胚、鸭胚这几种疫苗细胞来源于普通动物无法保证细胞不携带外源因子也不能保证细胞基质的致瘤性和细胞的DNA。人二倍体细胞疫苗(HDCV)1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，并进一步通过比较度验最终将来源于Semple疫苗生产用PM狂犬病毒株适应到WI-38人二倍体细胞株(后来又适应到MRC-5细胞株)。培养病毒经澄清、加热和β-丙内酯灭活、冻干制备成疫苗。该疫苗于1974年首次获准生产，并于1978年开始商品化。HDCV不含任何神经毒因子，并不含任何外源动物杂质，因而可以解释它在重复注射后较好的耐受。采用NIH法检测疫苗的稳定性证实，疫苗在4℃和37℃放置一个月后，无明显差异。进一步将5批效价4.3～5.6的疫苗4℃存放3年半，所有批号滴度均大于2.5IU/剂。早期调查发现，HDCV预防接种后1月或3月达到抗体峰值(10IU左右)，随后便逐渐降低，但1～2年内滴度始终大于0.5IU，通过1～3年内加强免疫后，抗体滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途径相近。HDCV的问世使人们对传统疫苗免疫原性的评价有了根据。Shah等证实2～4针HDCV接种人体后获得的抗体反应与14针Semple疫苗相当，Cost-Berger通过志愿者分别注射3针HDCV和SMBV，发现前者诱生的抗体反应是后者的5倍。通过HDCV和DEV比较也证实后者仅具有限的效力。Bahmanyar在当时得出的结论是，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和HDCV相比。人二倍体细胞(HDC)为正常核型细胞，无致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用，这使其成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。HDCV的缺点在于HDC不太容易培养，而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格非常昂贵。在美国，用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达一千多美元；而在巴基斯坦，用Semple疫苗进行全疗程处理只需2.5美元，这样就限制了该疫苗在发展中国家的使用。同时用该方法制备狂犬病疫苗的详细描述未见报道。由于狂犬病疫苗的特殊性和复杂性，制备该疫苗具有相当的难度，特别是在分离和纯化方面。原代细胞培养疫苗地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)用地鼠肾细胞组织培养狂犬病毒发展灭活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje进一步发展，将SAD狂犬病毒固定毒适应到地鼠肾细胞(PHKC)上生产灭活的疫苗，并获得成功。1968年该疫苗在加拿大批准用于人体加强和暴露前接种。我国的PHKCV由卫生部武汉生物制品研究所林放涛领导的小组研制而成。开始实验所用毒种为北京株兔脑固定毒，经″混合细胞培养法″在PHKC上适应，连续传50～60代适应成功；再经豚鼠脑和PHKC交替3次传代的毒株称为aG株。aG株病毒在PHKC上培养收获，福尔马林灭活，加Al(OH)3佐剂。疫苗规定效价为1.3～2.5IU，经超滤浓缩后，浓缩疫苗效价须≥2.5IU。经临床试验证明，各种剂型的PHKCV在人体中的抗体反应均优于羊脑Semple疫苗。该疫苗于1980年在我国获得国家卫生部批准的生产文号，取代Semple疫苗。在过去的十多年里，我国生产的PHKCV是世界上累计生产量最大的狂犬病疫苗，高峰年份每年此类疫苗的产销量超过500万人份。目前，我国各生产单位正逐步采用改进的浓缩-精制PHKCV。鸡胚细胞疫苗Kando 1965年将Flay HEP株适应到鸡胚细胞，培养病毒经β-丙内酯灭活、浓缩、冻干(后采用区带离心纯化加以改进)制备成疫苗并在日本商品化生产。1983年Barth等从上述日本疫苗分化出一种用Flary LEP株适应到鸡胚细胞上的纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV)。培养病毒采用β-丙内酯灭活、并经蔗糖梯度区带离心纯化和浓缩。该疫苗目前由德国Chiro Behring GmbH公司生产。人体暴露前后的临床试验结果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相当，并且不会诱生针对鸡细胞蛋白的抗体，使用该疫苗仅产生轻微的局部反应。PCECV现已在欧、亚、非、南美20多个国家获准使用。1997年10月FDA批准该疫苗进入美国市场。上述原代细胞培养疫苗具有的一个优点是不必冷冻保存细胞种。但每批疫苗检查培养器官源的杂质(细菌、支原体、病毒)，并且动物器官的可用量是限制工业化生产的因素。传代细胞系疫苗Vero细胞疫苗1984年由法国Merieun研究所研制成功。制备过程中采用了使细胞贴附在微载体上悬浮培养的微载体技术以便进行工业化大罐培养。该疫苗使用的病毒株与HDCV相同，为PM1503-3M。收获的病毒经超滤浓缩、密度梯度离心、β-丙内酯灭活制成冻干疫苗。早期研究证实，在100个接种的实验动物体内没有肿瘤和转移，每剂疫苗的残余细胞DNA量小于50pg，疫苗的稳定性极好，和HDCV相似。80年代和最近的大量实验证实无论用作暴露前人体免疫或暴露后处理，Vero疫苗均获得很好的免疫效果。由于该疫苗进口价相对较高，因此，我国从1995年开始进行色谱纯化的人用Vero细胞疫苗的研制。制备过程中使用的病毒株是适应到Vero细胞的狂犬病毒(CTN-1V)。目前已有包括卫生部上海生物制品研究所在内的多家生物制品研究所研制成功，并得到生产文号，以逐步取代我国现行的PHKCV。Vero细胞较HDC能生产较高的狂犬病毒滴度，并可利用微载体技术进行工业化大罐培养，因而其价格较HDCV便宜。目前使用Vero细胞已累积生产1亿剂脊髓灰质炎疫苗，2000万剂狂犬病疫苗和100万剂口服脊髓灰质炎疫苗，证实该细胞疫苗的安全性。但是用Vero细胞制备疫苗须在低细胞代数使用以确保无致瘤性，且残余细胞DNA量须小于100pg/剂。在发展中国家常常发生停电或难以保证液氮供应，保存细胞种源比较困难。因而限制了这种疫苗的使用，发展新型的人用狂犬病疫苗以降低成本，特别是找到难以解决的纯化工艺，是一项重要课题，本专利技术经过研究，找到了一种在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗，这些人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，所得到的疫苗，价格低廉，使用方便，纯度高，适合大规模生产和大规模应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种人用二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病纯化疫苗。本专利技术还提供本专利技术的狂犬病纯化疫苗的制备方法及其应用。本专利技术采用的人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，优选的是WI-38。经过全面的研究鉴定，WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性对病毒敏感的优点，符合中国药典2005版关于生物制品的传代细胞的规程要求。本专利技术提供一种人用二倍体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人用二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，其特征是，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种ＳＮＫ－ＣＴＮ毒种，经分离纯化得到的狂犬疫苗。
【技术特征摘要】
1.一种人用二倍体细胞狂犬病纯化疫苗，其特征是，该疫苗是在人用二倍体细胞上接种SNK-CTN毒种，经分离纯化得到的狂犬疫苗。2.权利要求1的纯化疫苗，其特征在于，所述狂犬病毒毒种选自狂犬毒种CTN株或aG株，所述人用二倍体细胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5。3.权利要求1的纯化疫苗，其特征在于，是冻干注射剂或水针剂。4.权利要求1的纯化疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)、人用二倍体细胞的复苏；(2)、人用二倍体细胞的培养扩增；(3)、在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种；(4)、收获病毒液；(5)、病毒液的灭活；(6)、纯化。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤(1)、灭活病毒后制成粗疫苗；(2)、澄清过滤；(3)、超...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔栋，
申请(专利权)人：崔栋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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