免疫刺激性核酸制造技术

本发明专利技术是有关免疫刺激性核酸组合物和利用这些组合物的方法。富含Ｔ的核酸含有多Ｔ序列和／或含有超过２５％的Ｔ核苷酸残基。ＴＧ核苷酸中含有ＴＧ双核苷酸，富含Ｃ的核苷酸含有至少一个多Ｃ区域和／或超过５０％的Ｃ核苷酸。这些免疫刺激性核酸与含有ＣｐＧ基元的核酸以相似的方式起作用。本发明专利技术同时包括优选的ＣｐＧ核酸。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
免疫刺激性核酸的制作方法本案为申请日为2000年9月25日，申请号为00814840.6的中国专利技术专利申请的分案申请。本专利技术的背景细菌的DNA在体外对外周血液单核细胞(PBMC)有直接免疫刺激效果，但是脊椎动物的DNA没有这样的免疫刺激效果。细菌DNA具有活化B细胞及天然杀伤细胞的免疫刺激作用，但脊椎动物的DNA没有(Tokunaga，T.，et al.，1988.Jpn.J.CancerRes.79682-686；Tokunaga，T.，et al.，1984，JNCI 72955-962；Messina，J.P.，et al.，1991，J.MeImmunol.1471759-1764；和在Krieg中的综述，1998，InApplied Oligonucleotide Technology，C.A.Stein and A.M.Krieg，(Eds.)，John Wiley and Sons，Inc.，Newyork，NY，pp431-448)。现在人们已经认识到这些细菌DNA的免疫刺激效果是因为未甲基化的CpG双核苷酸在特定的碱基环境中(CpG基元)中存在的结果，CpG基元在细菌的DNA中是很常见的，但是在脊椎动物的DNA中都是甲基化的和未被充分呈递的(CpG抑制作用，1/50到1/60)(Krieg et al，1995 Nature374546-549；Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta 933211-10)。这种细菌DNA的免疫刺激效果可以用合成的含有这些CpG基元的低聚脱氧核苷酸(ODN)来实现。很可能的是对CpG DNA反应的免疫活化作用可能发展成为识别对微生物分子特异的结构模式的先天免疫防御机理中的一个组成。CpG ODN对人类和鼠科动物的白细胞有很高的刺激作用，诱导所有(95％)B细胞的增殖以及细胞因子和免疫球蛋白的分泌；天然杀伤细胞(NK)溶解活性和IFN-γ的分泌；枝状细胞(DCS)和其它抗原呈递细胞的活化以表达共同刺激分子以及分泌细胞因子，特别是在促进类Th1的T细胞反应的发展中很重要的类Th1的细胞因子。CpG DNA对B细胞的活化作用是不依赖于T细胞的并且是抗原为特异性的。然而，对于B细胞增殖和Ig分泌，低浓度的CpG DNA对B细胞的活化作用与通过B细胞抗原受体传递的信号具有强烈的协同作用(Krieg等人，1995)。这种通过B细胞抗原受体和通过CpG DNA的B细胞信号传递途径之间的强烈的协同作用促进了抗原特异免疫反应。除了其对B细胞的直接作用，CpG DNA还直接活化单细胞，巨嗜细胞，和枝状细胞以分泌多种细胞因子，包括高含量的IL-12(Klinman等人，1996；Halpern等人，1996；Cowdery等人，1996)。这些细胞因子刺激天然杀伤细胞(NK)以分泌干扰素(IFN-γ)并且增加溶解活性(Klinman，等人，1996；Cowdery等人，1996，Yamamoto等人，1992；Ballas等人1996)。总之，CpG DNA诱导由IL-2和IFN-γ支配的Th1类模式的细胞因子的产出并少量分泌Th2细胞因子(Klinman等人，1996)。CpG DNA对B细胞的强烈的直接作用(不依赖于T细胞)，以及对能通过T-辅助性途径间接作用B细胞的细胞因子的诱导作用说明可以以ODN形式使用CpG DNA作为疫苗辅剂(参看PCT专利申请NoWO98/40100)。这些自然的磷酸二酯骨架的CpG低聚脱氧核苷酸的免疫刺激作用是具有高度的CpG特异性的，因为，如果CpG基元被甲基化变为GpC，或被减少，或被改变的话，这种免疫刺激作用就被从根本上破坏了。(Krieg et al，1995 Nature 374546-549；Hartmann et al，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 969305-10)。磷酸二酯CpG的ODN可以制备到类酯类、矾或其它类型的具有储存性能或者提高细胞吸收作用的介质中，以增加免疫刺激效果。(Yamamoto et al，1994 Microfiol.Immunol.38831-836；Gramzinski et al，1998 Mol.Med.4109-118)。在早期的研究中，人们认为免疫刺激CpG主要基元是按照如下的序列嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶排列的。(Krieg et al，1995 Nature 374546-549；Pisetsky，1996 J.Immunol.156421-423；Hacker et al.，1998 EMBO J.176230-6240；Lipford et al，1998Trends in Microbiol.6496-500)。但是，现在十分清楚的是老鼠的淋巴细胞与磷酸二酯CpG基元相同，而不是上述的“嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶公式基元”(Yi et al.，1998 J.Immunol.1605898-5906)，并且人类的B细胞和枝状细胞也是磷酸二酯CpG的基元。(Hartmann et al，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA969305-10；Liang，1996 J.Clin.Invest.981119-1129)。过去一些研究者考察了ODN中的核苷酸部分在脱离ODN序列的情况下能否继续有效果。很有趣的是，研究发现如果碱基的使用是随机的话，信使(antisense)ODN一般富含GG、CCC、CC、CAC和CG序列；然而却含有比预期要少的TT或TCC核苷酸序列(Smetsers et al.，1996 Antisense Nucleic Acid DrugDevelop.663-67)。这就增加了这种可能性过分表达的序列可能包含对于信使寡核苷酸或visa versa是优选的目标元素。在信使实验中避免使用富含胸腺嘧啶脱氧核苷的ODN的一个原因是细胞中的核酸酶使ODN降解释放出自由的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这种胸腺嘧啶脱氧核苷酸会与3H-腺嘧啶脱氧核苷酸产生竞争，而3H-腺嘧啶脱氧核苷酸是常用于测定细胞复制的实验中。(Matson et al.，1992 Antisense Research and Development 2325-330).本专利技术的概述本专利技术部分地是有关富含吡啶(Py-rich)和在一些实施方案中富含胸腺嘧啶脱氧核苷(T)的免疫刺激性核酸不需要CpG主要基元的存在。本专利技术还部分地有关一个发现含有TG双核苷基元的核酸同样具有免疫刺激性能。本专利技术部分地建立在不含CpG主要基元的核酸序列具有免疫刺激性能这个出乎预料的发现之上的。在分析许多核酸序列的免疫刺激性能的基础上，我们发现这些序列可能是富含吡啶(Py-rich)例如富含T，或者它们含有TG主要基元。我们还发现这些序列优先活化非啮齿动物的免疫细胞。与非啮齿动物的免疫细胞相比，至于啮齿动物的免疫细胞，Py-rich和TG序列只有很微小的免疫刺激活性。这样一来，使得在非啮齿动物身上通过使用Py-rich和TG具有免疫刺激性能的核酸导致免疫反应成为可能。本专利技术中的Py-rich和TG具有免疫刺激性能的核酸最好可以包括CpG主要基元。这些发本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含ＳＥＱＩＤＮＯ：９６４（５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’）核苷酸序列的免疫刺激性寡核苷酸在制备治疗患有癌症的受试体的药物中的应用，其中免疫刺激性寡核苷酸与抗－癌治疗物结合向受试 体施用。

【技术特征摘要】
US 1999-9-25 60/156,113;US 1999-9-27 60/156,135;US1.包含SEQ ID NO964(5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT 3’)核苷酸序列的免疫刺激性寡核苷酸在制备治疗患有癌症的受试体的药物中的应用，其中免疫刺激性寡核苷酸与抗-癌治疗物结合向受试体施用。2.包含SEQ ID NO964(5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT 3’)核苷酸序列的免疫刺激性寡核苷酸在制备治疗患有癌症的受试体的药物中的应用，其中药物与抗-癌治疗物一起使用。3.包含SEQ ID NO964(5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT 3’)核苷酸序列的免疫刺激性寡核苷酸在制备治疗患有癌症并服用抗癌治疗物的受试体的药物中的应用。4.权利要求1的应用，其中抗-癌治疗物是化疗药剂。5.权利要求1的应用，其中化疗药剂是氨甲叶酸、长春新碱、阿霉素(adriamycin)、cisplatin、无糖氯乙基亚硝基脲、5-氟二氧嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素(阿霉素)、达卡巴嗪(dacarbazine)，红豆杉醇(taxol)、fragyline，MeglamineGLA，valrubicin，carmustaine和poliferposan，MMI270，BAY12-9566，RAS famesyl转移酶抑制剂，famesyl transferate抑制剂，MMP，MTA/LY23514，LY264618/Lometexol，Glamolec，CI-994，TNP-470，Hycamtin/Topotecan，PKC412，Valspodar/PSC833，Novantrone/Mitroxantrone，Metaret/苏拉明(Suramin)，Batimastat，E7070，BCH-4556，CS-682，9-AC，AG3340，AG3433，Incel/VX-710，VX-853，ZD0101，ISI641，ODN 698，TA 2516/Marmistat，BB2516/Marmistat，CDP 845，D2163，PD183805，DX8951f，Lemonal DP 2202，FK 317，Picibanil/OK-432，AD 32/Valrubicin，Metastron/锶衍生物(strontium derivative)，Temodal/Temozolomide，Evacet/liposomal阿霉素，Yewtaxan/Placlitaxel，Taxol/Paclitaxel，Xeload/Capecitabine，Furtulon/Doxifluridine，Cyclopax/oral paclitaxel，Oral Taxoid，SPU-077/Ciplatin，HMR1275/Flavopiridol，CP-358(774)/EGFR，CP-609(754)/RASoncogene抑制剂，BMS-182751/oral platinum，UFT(Tegafur/Uracil)，Ergamisol/左旋咪唑，Eniluracil/776C85/5FU增强剂，Campto/左旋咪唑，Camptosar/Irinotecan，Tumodex/Ralitrexed，Leustatin/Cladribine，Paxex/Paclitaxel，Doxil/liposomal阿霉素，Caelyx/liposomal阿霉素，Fludara/Fludarabine，Pharmarubicin/Epirubicin，DepoCyt，ZD1839，LU79553/Bis-Naphtalimide，LU 103793/Dolastain，Caetyx/liposomal阿霉素，Gemzar/Gemcitabine，ZD0473/Anormed，YM 116，lodine seeds，CDK4和CDK2抑制剂，PARP抑制剂，D4809/Dexifosamide，fes/Mesnex/Ifosamide，Vumon/替尼泊苷，Paraplatin/Carboplatin，Plantinol/cisplatin，Vepeside/Etoposide，ZD 9331，Taxotere/Docetaxel，prodrug of guanine arabinoside，Taxane Analog，nitrosoureas，烷基化试剂例如melphelan和环磷酰胺(cyclophosphamide)，氨鲁米特(Aminoglutethimide)，天门冬酰胺酶(Asparaginase)，二甲磺酸丁酯(Busulfan)，Carboplatin，Chlorombucil，盐酸阿糖孢苷(Cytarabine HCI)，放线菌素D(Dactinomycin)，盐酸道诺霉素(DaunorubicinHCl)，雌二醇氮芥(Estramustine)磷酸钠，依托泊苷(...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿瑟M克里格，克里斯汀斯凯特，乔格沃尔默，
申请(专利权)人：衣阿华大学研究基金会，科勒制药股份公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]