结晶形式的普伐他汀的钠盐及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种新的微生物方法，通过在好气发酵下通过深层培养一种能够将式（Ⅱ）化合物６β－羟化的霉菌菌株，并且通过分离和纯化在所述生物转化过程中生成的式（Ⅰ）的所述产物，从通式（Ⅱ）的化合物（其中Ｒ代表一种碱金属或铵离子）制备化合物式（Ⅰ）。所述方法包括在含有可同化碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，培养一种能够将通式（Ⅱ）的化合物６β－羟化的Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　　ｍａｃｕｌａｔａ丝状霉菌菌种的菌株，并且从所述发酵肉汤中分离生成的所述产物，然后分离并纯化式（Ⅰ）的所述化合物。本发明专利技术还公开了Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　　ｍａｃｕｌａｔａ的多种新菌株。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的培养物，以及用于制备普伐他汀的方法，具体地说，涉及以工业规模生产普伐他汀的微生物方法。本专利技术也涉及。
技术介绍
动脉粥样硬化、尤其是冠状血管闭塞最危险的因素是血浆的高胆固醇水平。最近二十年，对作为胆固醇生物合成限速关键酶的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(EC.1.1.1.34)进行了深入地研究。普伐他汀，一种式I的化合物， 以及其它相关化合物(密实菌素、美维诺林(mevinolin)、辛伐他汀)是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂。普伐他汀最先由M.Tanaka等(未公开的结果)在研究密实菌素代谢期间从狗尿中分离出来(Arai，M.等，Sankyo Kenkyusyo Nenpo，40，1-38，1988)。目前，普伐他汀是一种降胆固醇药，其在治疗中具有最有利的作用机制。它最重要的特征是组织选择性，即在胆固醇生成(cholesterogenesis)的两个主要部位例如在肝脏和在小肠中它抑制胆固醇的合成，而在其它器官很难检测到限制作用的胞内酶。然而，美维诺林和辛伐他汀的胆固醇生物合成限制作用在大多数器官中却是显著的(T.Koga等，Biochim.Biophys.Acta，1045，115-120，1990)。普伐他汀在化学结构方面本质上不同于更具亲脂特征的美维诺林和辛伐他汀。在后二种化合物的情况下，与六氢化萘骨架的C-1碳原子连接的取代基的末端位于六元内酯环中，而在普伐他汀的情况下，不存在所述内酯环，而是存在生物活性的开链二羟酸的钠盐形式。另一重要的结构差别是美维诺林和辛伐他汀在六氢化萘环的C-6-位置是甲基，而在普伐他汀中可以见到一个羟基，这导致在其亲水特征方面进一步增强。作为上述结构差异的结果，普伐他汀只能够极低程度地穿透外周细胞的亲脂膜(A.T.M.，Serajuddin等，J.Pharm.Sci.80，830-834，1991)。可以通过两个发酵过程达到工业化生产普伐他汀。在第一个发酵过程中，制备微生物阶段的密实菌素，然后在第二个发酵过程中，在6β-位置上，通过微生物羟化作用，使作为底物的密实菌素酸的钠盐转化为普伐他汀。按照公开的专利，用属于不同属的霉菌菌种、和用属于诺卡氏菌属(Nocardia)的丝状细菌、用马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)，可以在不同程度上完成密实菌素的微生物羟化作用(比利时专利说明书第895090号、日本专利说明书第5,810,572号、美国专利第4,537,859和4,346,227号和公开的欧洲专利申请号0605230)。公开了使用丝状霉菌例如冻土毛霉(Mucor hiemalis)、Syncephalastrum nigricans、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)以500μg/ml浓度和用属于原核生物的诺卡氏菌属、马杜拉放线菌属和链霉菌属的菌株以2000-4000μg/ml进行密实菌素底物的生物转化。在用丝状霉菌生产普伐他汀的情况下经历的一个常见问题是由于密实菌素的抗真菌作用，引起微生物不能耐受添加到培养物中甚至低浓度的密实菌素底物(Serizawa等，J.Antibiotics，36，887-891，1983)。日本研究人员用Streptomyces carbophilus深入研究羟化作用时，也观察到该底物的细胞毒性(M.Hosobuchi等，Biotechnology andBioengineering，42，815-820，1993)。日本作者已设法用重组DNA技术改进Streptomyces carbophilus菌株的羟化能力。密实菌素的羟化作用需要细胞色素P-450单加氧酶系统(Matsuoka等，Eur.J.Biochem.184，707-713，1989)。然而，根据所述作者的研究，在细菌的细胞色素P-450单加氧酶系统中，不是一种而是数种蛋白在电子传递中起作用，这使得所述DNA技术的应用更加困难。开发出用于生产普伐他汀的成本有效的微生物羟化法是极其艰难而复杂的工作。本专利技术的目的是详细描述一种用于工业规模从密实菌素生产普伐他汀的新的微生物方法，所述方法会比先前已知的那些方法在更为有利的条件下生产普伐他汀。在我们的研究工作期间，我们尝试了以上所有研究，以发现含有可能适合于使密实菌素微生物转化为高浓度的普伐他汀的羟化酶的微生物菌株。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于从式(II)的底物化合物 其中R代表一种碱金属或铵离子， 制备式(I)化合物的微生物方法，所述方法包括以下步骤(a)在含有可同化的碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，培养能够将式(II)化合物6β-羟化的Mortierella maculata丝状霉菌菌种的菌株；(b)将待转化的底物添加到所形成的Mortierellamaculata培养物中；(c)让所述底物发酵直至生物转化结束为止；(d)从所述培养物肉汤中分离式(I)的化合物；和(e)分离纯化所述式(I)的化合物。本专利技术还涉及保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心、保藏号为NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n.sp.E-97菌株的生物学上纯的培养物；以及所述菌株的突变株Mortierellamaculata n.sp.E-97/15/13菌株的生物学上纯的培养物，该突变株保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心，保藏号为NCAIM(P)F 001267。附图说明图1说明Mortierella maculata n.sp.E-97的物理特征。具体实施例方式在我们筛选程序的过程中，覆盖了大约5500种原核和真核菌株，选定了23种微生物，所述23种微生物反过来能够羟化密实菌素的。在这些菌株中，一种丝状霉菌证明是更适合于生产普伐他汀，因为与来自公开专利的已知菌株比较，它对密实菌素的抗性较高。按照分类学研究，该菌株证明是一种属于被孢霉属(Mortierella)的新的代表性菌种(Mortierella maculata n.sp.)。从所选定的霉菌中，一方面，通过应用突变-选择方法，另一方面，通过诱导所述菌株的羟化酶，分离到一种新菌株，所述新菌株能够比迄今为止公开的菌株以更高浓度使密实菌素底物羟化成普伐他汀。作为诱变剂，可使用物理和化学诱变剂(UV照射、甲磺酸甲酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)。诱变处理之后，为了制备单倍体细胞，将孢子悬液涂布在含benomyl的琼脂平板上，然后为了诱导羟化酶，将形成的菌落接种在100μg/ml含8-脱-(2-甲基-丁酰)-密实菌素或含密实菌素的琼脂平板上。通过这些方法的应用，从能够在显著高于亲代菌株的程度上使密实菌素转化为普伐他汀的新菌株中制备突变菌株。在优化实验的过程中，我们确定了用于密实菌素羟化作用的最有益的接种物和最有利的生物转化培养基以及以高浓度重复添加密实菌素的最佳方法。因此，本专利技术基于对名为Mortierella maculata的分离的霉菌的命名为E-97和E-97/15/13菌株的鉴别，所述菌株保藏于国立农业和工业微生物保藏中心(Department of Microbiology and Biotechno本文档来自技高网...

【技术保护点】
结晶形式的普伐他汀的钠盐。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A杰克，A康雅，I巴塔，E伊尔科伊，G索莫伊，G阿姆布鲁斯，G霍尔瓦斯，K阿尔布雷希特，IM沙波，J莫泽斯尼苏托，J萨拉特，A安多尔，L比林斯克，S波罗斯，I朗，M比德洛尼伊格洛伊，
申请(专利权)人：药物研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：HU[匈牙利]