用于产生4-羟基-L-异亮氨酸的方法技术

本发明专利技术提供来自苏云金芽孢杆菌的新的高活性Ｌ－异亮氨酸双加氧酶。还提供一种制备（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）－４－羟基－Ｌ－异亮氨酸或其盐的方法，该方法包括在Ｌ－异亮氨酸双加氧酶存在下使Ｌ－异亮氨酸在水性溶剂中反应，和分离产生的（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）－４－羟基－Ｌ－异亮氨酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微生物工业，并具体涉及新的双加氧酶和制备4-羟基-L-异 亮氨酸或其盐的方法。
技术介绍
4-羟基-L-异亮氨酸是能够从胡卢巴(fenugreek)种子(豆科胡卢巴 (7Hgcwe〃/oewMm-graecww丄./egww/wa ae))4是取禾口纟屯^f匕的一种氨基酉交。4-羟基 -L-异亮氨酸显示引起强烈兴趣的促胰岛素活性，因为它的刺激作用明显依赖 于介质中的血浆葡萄糖浓度，正如在离体灌注的(isolated perfUsed)大鼠胰脏和 人胰岛中所证明的(Sauvaire, Y.等，Diabetes, 47: 206-210, (1998》。对于磺酰脲 未确认这种葡萄糖依赖性(Drucker,D. J.， Diabetes 47: 159-169,(1998))，磺酰脲 是目前用于治疗II型糖尿病[或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDD或NIDDM) (non-insulin-dependent diabetes (NIDD) mellitus (NIDDM))]的唯一促胰岛素药 物，因此低血糖仍是磺酰脲治疗的一个普遍的、不理想的副作用(Jackson, J. 和Bessler, R. Drugs, 22: 211—245; 295-320， (1981); Jennings, A.等，Diabetes Care: 12: 203-208, (1989))。葡萄糖耐受的改善也是已知的(Am. J. Physiol. Endocrinol.: Vol. 287, E463-E471, 2004)。已经报道了这种葡糖代谢增强活性，和它用于药 物和保健食品的潜在应用(特开平6-157302, US2007-000463A1)。仅存在于植物中的4-幾基-L-异亮氨酸，由于它的特殊似l夷岛素作用，可能 被认为是新的促分泌素，对于治疗II型糖尿病具有潜在的重要性，所述II型糖 尿病是一种特征在于与不同程度胰岛素抗性相关的缺陷性胰岛素分泌的疾病 (Broca， C.等,Am. J. Physiol. 277 (Endocrinol. Metab. 40): E617画E623， (1999》。一种通过利用胡卢巴^是取物中的双加氧酶活性将4^、抗坏血酸、2-酮戊 二酸(2-oxyglutaric acid)和氧依赖性异亮氨酸氧化的方法，作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法已有报道(Phytochemistry, Vol. 44, No. 4, pp. 563-566, 1997)。 然而，这种方法作为制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法并不令人满意，因为在 20mM及以上的异亮氨酸浓度，所述酶的活性受到底物的抑制，该酶尚未得到鉴定，该酶源自植物提取物并且不易大量获得，并且该酶不稳定。已经公开了一种有效的光学纯(optically pure) pS^R，4S)4-羟基异亮氨 酸的八步合成，其总产率为39%。这种合成的关键步骤涉及用白地霉 (GeoWc/7ww caw/Wwm)将乙基2-曱基乙酰乙酸生物转化为乙基(2S,3S)-2-曱基 —3-羟基—丁酸酯和不对称Strecker合成(Wang, Q.等,Eur. J. Org. Chem., 834-839 (2002))。还公开了 (2S,3R，4S)-4-羟基异亮氨酸的 一 种完全控制立体化学(total control of stereochemistry)的简短六步化学酶促合成，最后的步骤是通过使用 商业上可以获得的固定在Eupergit C(E-PAC)上的青霉素酰化酶G (penicillin acylase G)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促溶解(Rolland-Fulcrand, V.等，J. Org, Chem.， 873-877 (2004))。但在目前，尚未报道对任何L-异亮氨酸双加氧酶的克隆和通过使用L-异亮氨酸双加氧酶直接酶促羟化L-异亮氨酸来产生(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异 亮氨酸。至于由微生物产生异亮氨酸类似物，已报道了通过芽孢杆菌属(Sfl〃w) 细菌产生2-氨基-3-酮-4-曱基戊酸(AMKP) (Bioorganic Chemistry, Vol. 6, pp.263-271 (1977))。然而，没有关于源自微生物的异亮氨酸轻化酶的报道。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供通过使用源自微生物的酶来产生4-羟基异亮 氨酸(用于表示包括它的游离形式和盐形式两者，并且可称作4HIL,下同) 的方法，该方法能够以大量制备4-羟基异亮氨酸。本专利技术的目的包括提供具有从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的酶活性 的微生物，和基于使用源自微生物的酶的羟化反应从异亮氨酸产生4-羟基异 亮氨酸的方法。上述目的通过发现具有从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸的酶 活性的微生物来实现。本专利技术的一个目的是提高(2S,3R,4S)-4-羟基-L-异亮氨酸(用于表示包括 它的游离形式和盐形式两种，并且可称作(2S，3R,4S)-4HIL，下同)的产生， 提供通过使用L-异亮氨酸双加氧酶或具有所述L-异亮氨酸双加氧酶活性的 细菌直接酶促羟化L-异亮氨酸来制备(2S,3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐 的方法。考虑前述问题而进行了大量研究，结果，本专利技术的专利技术人从自然界分离了一种具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌，克隆了编码该L-异亮氨酸双加氧酶的基因，并且发现了该L-异亮氨酸双加氧酶可优选用于合 成期望的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，由此完成了本专利技术。也就是说，本专利技术的目的包括提供新的L-异亮氨酸双加氧酶和编码该 L-异亮氨酸双加氧酶的DNA,以及使用该L-异亮氨酸双加氧酶产生 (2S,3R,4S)-4-轻基-L-异亮氨酸的方法。上述目的通过发现本专利技术的新L-异亮 氨酸双加氧酶而实i见。在下文中将详细描述本专利技术。本专利技术的一个目的是提供产生4-羟基异亮氨酸及其盐的方法，其包括通 过如下产生4-羟基异亮氨酸的步骤在源自微生物的羟化酶存在下对异亮氨 酸或其盐进行羟化反应，并从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述微生物是属 于芽孢杆菌属的微生物。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述属于芽孢杆 菌属的微生物是选自苏云金芽孢杆菌(Bo7/w AwnV^'e^)、地衣芽孢杆菌 C6(3c/〃ws //c/zewy^m&)、 3求形芽孑包才干菌(6a7/w5 s/ /zaen-CMS)、蜡^)犬芽孑包4干菌 (Bac/〃ws cerew力和韦氏芽孑包杆菌(5ac/〃ws wez77erafe; /zwem^)的孩i生物。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述羟化反应在 制备自对数生长期微生物细胞的细胞裂解物存在下进行。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中对L-异亮氨酸进 4亍羟卩t反应。本专利技术进一步的目的是提供如上所述的产生方法，其中所述羟化酶是双力口氧酶。本专利技术进一步的目的是l是供如上所述的产生方法，其中所述羟化酶具有 以下特性(a) 需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b) 最适反应pH为5-8，(c) 最适反应温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生４－羟基异亮氨酸或其盐的方法，包括产生４－羟基异亮氨酸的步骤，其中通过使异亮氨酸或其盐在源自微生物的羟化酶存在下进行羟化反应并从异亮氨酸产生４－羟基异亮氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2006-9-28 265452/2006;US 2006-10-16 60/829,577;1.一种产生4-羟基异亮氨酸或其盐的方法，包括产生4-羟基异亮氨酸的步骤，其中通过使异亮氨酸或其盐在源自微生物的羟化酶存在下进行羟化反应并从异亮氨酸产生4-羟基异亮氨酸。2. 根据权利要求1的产生方法，其中所述微生物是属于芽孢杆菌属的微 生物。3. 根据权利要求2的产生方法，其中所述属于芽孢杆菌属的微生物是选 自以下的微生物苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜡状芽 孢杆菌和韦氏芽孢杆菌。4. 根据权利要求1-3中任一项的产生方法，其中所述鞋化反应在制备自 对数生长期的微生物细胞的细胞裂解物存在下进行。5. 根据权利要求1-4中任一项的产生方法，其中对L-异亮氨酸进行羟化 反应。6. 根据权利要求1-5中任一项的产生方法，其中所述羟化酶是双加氧酶。7. 根据权利要求1-6中任一项的产生方法，其中所述羟化酶具有以下特性(a) 需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b) 最适反应pH为5-8，(c) 最适反应温度为45°C或更低，(d) 在S0。C或更高失活，(e) 受到EDTA、 Cu2+和Zn2+抑制。8. —种双加氧酶，其具有以下特性并且可以从芽孢杆菌属细菌分离(a) 需要氧、Fe2+、抗坏血酸和2-酮戊二酸作为辅因子，(b) 最适反应pH为5-8，(c) 最适反应温度为45°C或更低，(d) 在S0。C或更高失活，(e) 受到EDTA、 Cu2+和Zn2+抑制，(f) 如通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量，包含分子量为 29000 ±2000的亚基，(g) 在N末端具有SEQ ID NO: 5的#^酸序列。9. 根据权利要求8的双加氧酶，其中所述芽孢杆菌属细菌是苏云金芽孢杆菌。10. —种选自下组的DNA:(a) 包含SEQ ID No: 1的核苦酸序列的DNA;(b) 在严紧条件下与具有SEQ ID No: 1核苦酸序列的互补核香酸序列的 DNA杂交并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA;(c) 编码包含SEQ ID No: 2的氨基i^f列的蛋白质的DNA;(d) 编码具有如下^JJ臾序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质 的DNA,所述^Il&酸序列在SEQ ID No: 2的氨基酸序列中包含一个或几个氨 基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位；和(e) 编码具有如下氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质 的DNA，所述氨基S交序列与SEQ ID No: 2的^i^酸序列是至少98%同源的。11. 一种重组DNA，其通过将根据权利要求10的DNA与载体DNA连 接获得。12. —种由根据权利要求11的重组DNA转化的细胞。13. —种用于产生具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的方法，其包 括将根据权利要求12的细胞在培养基中培养，和在培养基和/或细胞中积累 具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质。14. 一种选自下组...

【专利技术属性】
技术研发人员：小寺智博，瑟奇V斯米尔诺夫，纳塔利亚N萨姆索诺瓦，维罗尼卡A科特利亚罗瓦，纳塔利亚Y拉什克维克，尤里I科兹洛夫，清水昌，小川顺，日比慎，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]