微腔板及其制造方法技术

本发明专利技术涉及微腔板及其制造方法，更具体地涉及一种便于实时测量和分析从包含引物或探针的多个反应溶液（选择性地绑定到每个对应的基因）的反应获得的荧光以便分析包含多个基因的生物样本而不会交叉污染的微腔板及其制造方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微腔板(micro-chamber plate)及其制造方法，更具体地涉及一种便 于实时测量和分析从包含引物(primer)或探针的多个反应溶液(选择性地绑定到每个对 应的基因)的反应获得的荧光以便分析包含多个基因的生物样本而不会交叉污染的微腔 板及其制造方法。
技术介绍
微腔板是这样一种容器，其中发生了多达数微升的微小反应。这种微腔板可以由 硅晶片、玻璃、金属或塑料构成。微腔板是一种其中所述微腔以2维形式排列的板。在该板 中，用于样本输入的入口位于一侧，而另一侧由透明材料制成以便观察内部反应。为了测量基因量，开发出了实时聚合酶链反应(PCR)与PCR共同执行，PCR方便了 对与基因量成比例增加的荧光的测量。在实时PCR中，在每个周期内测量从PCR产品产生的荧光，并且确认给出至少所需 荧光的特定周期，这导致对某一具体基因的早期浓度的量化。当PCR完成时，实时PCR不需要电泳(electrophoresis)，而是随着PCR —起进 行，并且有助于产品的量化，准确来讲，其实现了具有至少109浓度范围中的具体核酸序列 的基因的量化(“A-Z of Quantitative PCR edited by Stephen A. Bustin 2004—2006 International University, RealtimePCR edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group)。已经开发了用于分析多个样本的实时PCR的多种装置，通过使用标准96孔板或 384孔板(Roche Light cycler 480, ABI 7500,7900)来分析96个或384个基因的设备对 它们进行举例说明。Roche提供的实时PCR设备要求10_50微升的样本量，这是一个很大的量。为了解决以上问题，提出了不同的方法，通过利用MEMS (微电子机械系统)技术减 少样本量在短时间段内分析多个样本。一个例子是使用微腔阵列板的方法。使用微腔阵列板的方法由以下步骤组成在微腔中加载反应样本；密封每个微腔 以隔离每个反应溶液；诱发反应并对其进行分析。具体地讲，样本溶液被添加到微腔中。用于细胞培养的透明微腔板被覆盖了半 透明隔膜以将微腔彼此隔离开。在每个微腔中仅培养一个细胞。接着，培养基(culture medium)被去除，向其添加Taqman反应溶液，并用清油进行密封以防止蒸发。用温度循 环(temperature cycling)来测量板底部上的荧光(YASUDA, Kenji EP 1，541，678 Al, JP 2002245900NUCLEIC ACID ANALYSIS CHIP AND NUCLEIC ACID ANALYZER)。根据上述方法，要使用微量吸管将不同的溶液加载到每个微腔中，这耗费了很 长的时间。具体地讲，为了将样本注入到至少1536个微腔中，必须有微型自动分配器 (dispenser) 0在注入每种溶液之后，必须清洗该微型自动分配器，这将消耗很长时间。因 此，实际上很难使用超过384个板。第二，为了克服上述问题，E.Tamiya集团的Hdenori Nagai提出了一种反应器， 其中通过光刻和化学蚀刻由硅晶片构成了微腔阵列(Anal. Chem. 2001 73，1043-1047， Development of a Microchamber Array forPicoliter PCR)。所述反应器使用显微镜载物片盖玻片来防止PCR溶液的蒸发。但是，当盖玻片被 拿开时，存在反应溶液发生交叉污染的机会。因此，防水隔膜被插入在盖玻片和晶片之间。 接着，首先去除盖玻片，然后在反应溶液干燥之后去除抗水隔膜，之后进行分析。上述处理 是比较麻烦的。因此，该反应器在实时基因量化放大方面的可用性是有限的。第三，为了克服根据上述量化放大的问题，同一实验室的Y. Matsubara等人开发 了一种微腔阵列，其通过以下步骤来制备使用微阵列装置在晶片上的凹形微腔中加载每 禾中引物；以及使其干燥(7thInternational Conference on Miniaturized Chemical and BiochemicalAnalysis Systems October 5-9,2003, Squaw Valley California USA)。在该微腔阵列中，芯片的上部被覆盖了矿物油以完全密封该微腔，接着使用纳米 喷射分配器将PCR反应混合物加载在矿物油上。根据该方法，通过光刻和化学蚀刻用硅晶 片(1x3英寸)制成了 1248个容量为50纳升(0. 65X0. 65X0. 2mm)的微腔阵列芯片。使 用纳升分配器在微腔中分配引物和Taqman探针溶液，之后进行干燥。整个芯片用矿物油涂 敷，因此每个微腔都被分开和密封。根据上述第三种方法制成的微腔阵列对于PCR是有利的，反应成分之间没有交叉 污染。具体地讲，根据该方法，将Taq DNA聚合酶和样本DNA的混合溶液喷洒在矿物油(分 配在每个微腔中)的顶部，引起微腔中的每个反应成分的PCR而没有交叉污染。然而，以上方法还存在以下问题。该方法需要微阵列纳升分配器来注入溶液。分 配要花费很长时间。而且由于在移动板的过程中矿物油的流动，反应溶液之间发生交叉污 染的可能性很高。另外，温度循环过程中在高温下形成了气泡。由于油和水溶液的疏水性 而引起的透镜效果将水溶液变为球形，这是另一个问题，造成了在光学测量期间激发光的 散射和色散并且发光，从而使得测量误差更大。第四，开发了有助于比以上第三示例多得多的反应的PicoTiterPlate，尽管该 微腔也是通过类似于第三示例的化学蚀刻制成的(John H. Leamonet al. , A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discretepico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003,24,3769-3777)。根据该方法，以39. 5pl的量同时发生了 300，000个独立的PCR反应。但是，该方法需要用于固定引物/探针的载物片，这使得它不适于进行要求平坦 光学特性的实时量化PCR。第五，提出了“膜反应器(或DNA卡)”(美国专利第5948673号)以对微样本起反应。膜反应器由三层薄膜组成。准确地讲，下层膜形成了反应器的底部，中间膜形成了 反应器的侧部，而上层膜形成了样本入口。在使用吸液管注入了微样本溶液之后，入口必须 被完全密封以便进行反应。如果入口没有被完全密封，在PCR过程中反应溶液就可能蒸发。 为了同时处理上千个样本，所述膜反应器必须变得很复杂。因此，这种反应器很难在实际中 使用。第六，在W0 02/40158和US 6，232，114中描述了具有标准ELISA板尺寸并且有助5于1536个荧光分析反应的反应板。对于板而言，在板中穿透了多个孔，并且在板上附接了具有弱荧光的透明膜，从而 形成了多个反应容器。试剂被加载在这些容器中，并且用透明膜来密封这些容器，之后进行反应。该反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微腔板，该微腔板包括：主体（１１０），其具有位于一侧的可实现光学测量的光学测量部分（１１３）和位于另一侧的用于样本注入的入口部分（１１２），并且容纳了通过多个开放空间彼此隔开的微腔（１１１）；透明层（１２０），其用于密封位于所述主体（１１０）的一侧的所述光学测量部分（１１３）；以及注入层（１３０），其被设计为遮挡位于所述主体（１１０）的另一侧的所述入口部分（１１２）而将包含样本的公共试剂加载到所述微腔板（１１１）中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR 2007-11-30 10-2007-0124012;KR 2008-3-5 10-2008-一种微腔板，该微腔板包括主体(110)，其具有位于一侧的可实现光学测量的光学测量部分(113)和位于另一侧的用于样本注入的入口部分(112)，并且容纳了通过多个开放空间彼此隔开的微腔(111)；透明层(120)，其用于密封位于所述主体(110)的一侧的所述光学测量部分(113)；以及注入层(130)，其被设计为遮挡位于所述主体(110)的另一侧的所述入口部分(112)而将包含样本的公共试剂加载到所述微腔板(111)中。2.根据权利要求1所述的微腔板，其中，在形成所述注入层(130)之前，所述微腔 (111)加载了包含用于核酸分析的引物或探针的特定成分(A)。3.根据权利要求1所述的微腔板，其中，当完成注入包含样本的公共试剂时，用粘性 膜、水基包皮形成成分、油或在常温下为固体的固体成分来密封所述注入层(130)。4.根据权利要求2所述的微腔板，其中，所述微腔(111)还被加载了核酸放大酶、dNTP 或缓冲剂。5.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述注入层(130)由可打孔膜制成，并且所述 注入层(130)被打孔以与所述微腔(111)相连接。6.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述注入层(130)由多孔材料制成。7.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述透明层(120)由在0°C 100°C温度下不 变形的材料制成。8.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)通过所述主体(110)上的 所述入口部分(112)区域的突起而在上部包含开放空间(114)，并且公共试剂或样本被直 接加载到形成在所述注入层(130)顶部上的所述开放空间(114)中以被递送到所述微腔 (111)中。9.根据权利要求8所述的微腔板，其中，在板的一侧形成有供应部分(141)用于引入 包含样本的公共试剂，并且还形成有样本供应层(140)以便排出气体和遮挡所述开放空间 (114)。10.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)被浸泡在填充有包含样本 的公共试剂的分离容器中以使所述包含样本的公共试剂被加载到所述微腔(111)中。11.根据权利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔(111)的宽度(L111)是0.3 3mm。12.根据权利要求11所述的微...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴翰浯，宋邱永，
申请(专利权)人：株式会社百奥尼，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]