用于生产赤松素的代谢改造细胞制造技术

使用经遗传改造的微生物进行赤松素生产，所述微生物具有产生肉桂酰辅酶Ａ和通过茋合酶的作用由其产生赤松素的有效代谢途径。所述肉桂酸可通过Ｌ－苯丙氨酸氨裂合酶（ＰＡＬ）由Ｌ－苯丙氨酸形成，ＰＡＬ是一种接受苯丙氨酸为底物并由其产生肉桂酸的酶，优选使得如果该ＰＡＬ还接受酪氨酸作为底物并由其形成香豆酸，则所述ＰＡＬ的Ｋｍ（苯丙氨酸）／Ｋｍ（酪氨酸）比值小于１∶１，并且如果所述微生物产生肉桂酸－４－羟化酶（Ｃ４Ｈ），则Ｋ↓［ｃａｔ］（ＰＡＬ）／Ｋ↓［ｃａｔ］（Ｃ４Ｈ）的比值为至少２∶１。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体而言涉及赤松素这种多酚的生产。此外，本专利技术涉及产 生赤松素的天然或重组微生物用于生产食品、飼料和饮料的用途。
技术介绍
利用微生物生产化学品是生物技术的一种重要应用。开发这样的生物生产方法的步骤一般可包括l)选择合适的微生物宿主，2)消除产生 副产物的代谢途径，3)使期望的途径在酶活性水平和转录水平都失去 调节，和4)过表达期望途径中的适当酶。在一些优选的方面中，本发 明利用以上步骤的组合，通过植物苯基丙烷类(phenylpropanoid )途 径的酶使来自苯丙氨酸的碳流重新定向，所述苯基丙烷类途径为期望的 赤松素生物合成提供必要的前体。赤松素(或称为银松素或3,5-二羟基反式茛)是一种属于芪类植物 抗毒素的植物酚，芪类植物抗毒素是构成植物中应答于感染或其他胁迫 相关事件的主动防御机制的低分子量次级代谢物。芪类植物抗毒素包含 芪骨架(反式芪)作为其共同的基本结构还可通过添加其他基团进行 补充(Hart和Shrimpton, 1979, Hart， 1981)。贫类可见于某些树木中(被 子植物、棵子植物)，但也可见于一些草本植物中(在桃金娘科(A^T似CCfle)、 葡萄科(和豆科(legW柳/W0Sfle )物种中)。 所述化合物对有害生物(特别是对真菌、细菌和昆虫)具有毒性。仅有 少数植物能够合成芪类或者以足以抵抗昆虫的量提供芪类。基本芪骨架的合成通过芪合酶进行，在多数所检查物种中该酶包括一个小基因家族(Kodan等2002)。芪合酶似乎是由查耳酮合酶演化而 来，属于具有超过65%氨基酸同源性的聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)超家族。与细菌PKS不同，芪合酶和查耳酮合酶都作为具有单 个活性位点的单模块PKS发挥作用，形成相对小的同型二聚体(Tr叩f 等，1995)。芪合酶和查耳酮合酶使用共同的底物三种丙二酸单酰辅酶 A和一种肉桂酰辅酶A/对香豆酰辅酶A,通过类似的反应机制形成其产物(Kindl, 1985)。芪合酶可归类到4-香豆酰辅酶A特异性类型(使用4-香豆酰辅酶A作为底物时具有最高活性，例如白藜,醇合酶(EC 2.3.1.95))中，或者归类到肉桂酰辅酶A特异性类型(使用肉桂酰辅酶 A作为底物时具有最高活性，例如赤松素合酶(EC 2.3.1.146))中。编 码白藜芦醇合酶的基因之前已就花生(y^flc/i/s (Schoppner和Kindl, 1984; Schroder等，1988)和葡萄vi(^mj (Melchior和KindL 1991; Wiese等，1994)进行了描述，而编码赤松素合酶的基因主要针对松 树(P/i/s /ve欲/s和i*,7iMS s加6m^ 进行了描述(Schanz等，1992; Raiber等，1995; Kodan等，2002; Hemingway等，1977)。赤松素存在于桉树、云杉树和松树例如欧洲赤松(iVws sj/veWWs)、 赤松CP/s1 ^isiyZoffl)、 火炬松(PiVi5似^i)和北美乔松CP/ws1 sfn^s) 的木浆中。在松树中，赤松素组分仅存在于心材中(Kindl， 1985)。然而， 该化合物作为对损伤、真菌攻击或环境胁迫(如UV照射和臭氧接触) 的应答而在边材、韧皮部和针叶中被诱导出来(Hart, 1981; Kindl, 1985; Richter和Wild， 1992; Lieutier等，1996; Rosemann等，1991)。该化合 物具有针对广泛的真菌种类的高效抗真菌活性(Lindberg等， 2004; ,Pacher等，2002)。赤松素(图1,反式)由两个紧密连接的酚环组成，因此属于多酚。 与多数其他羟基芪不同，赤松素缺乏环B中的羟基(图1)，由未取代 的肉桂酰辅酶A和三个丙二酸单酰辅酶A分子缩合而成。也就是说， 赤松素在结构上类似于红酒中发现的三羟基芪一一白藜，醇(Aggarwal 等，2004)。已经有许多数据证实了白藜,醇在健康方面的益处。例如， 白藜声醇在许多癌细胞系中的高效抗癌活性已经非常明确(Aggarwal 等，2004)。由于在结构上与白藜，醇的相似性，预计赤松素也具有高效 的健康益处。事实上，已经研究了赤松素对多种癌症的作用，包括结肠 直肠癌和肝癌，并已显示其化学预防和抗白血病的活性(Skinnider和 Stoessl， 1986;. Mellanen等，1996; Roupe等，2005以及2006)。此外，赤 松素还具有抗氧化剂的能力，尽管程度低于例如白藜芦醇(Stojanovic等， 2001)。目前，赤松素大多在多种黄酮类的混合物中获得，该混合物提取自 松树皮。所述提取是产率^f艮低的劳动密集型方法。在一些优选的方面中，本专利技术提供新的更为高效且高产率的生产方法。在植物中，苯基丙烷类途径负责合成多种次级代谢化合物，包括木 质素、水杨酸、香豆素、羟基肉桂酰胺、色素、类黄酮和植物抗毒素。事实上，芪类在植物中的形成通过苯基丙烷类途径进行。通过L-苯丙氨 酸氨裂合酶(L-phenylalanine ammonia lyase, PAL )，经由非氧化脱氨 基作用将氨基酸L-苯丙氨酸转化成反式肉桂酸(图2)。从反式肉桂酸 开始，该途径可分支成形成白藜芦醇的途径或形成赤松素的途径。在笫 一个途径中，通过肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H )( — 种细胞色素P450单加氧酶)与NADPH:细胞色素P450还原酶 (cytochrome P450 reductase, CPR)的结合，将反式肉桂酸在对位羟 化成4-香豆酸(4-羟基肉桂酸)。其后，接着通过4-香豆酸-辅酶A连接 酶(4-coumarate-CoAligase,4CL)的作用将4-香豆酸活化成4-香豆酰 辅酶A。接着， 一种白藜^醇合酶(VST1)可催化4-香豆酰辅酶A的 苯基丙烷单元与丙二酸单酰辅酶A缩合，从而形成白藜芦醇。在后一途 径中，通过4CL的作用将反式肉桂酸直接活化成肉桂酰辅酶A，其中 赤松素合酶(pinosylvin synthase, PST )随后催化肉桂酰辅酶A中苯基 丙烷单元与丙二酸4酰辅酶A的缩合，从而形成赤松素。芪合酶是一些底物相当广泛的酶，能接受多种生理及非生理底物。 例如，体外加成多种苯基丙烷辅酶A起始酯类导致形成若干产物(Ikuro 等，2004; Morita等，2001)。类似地，已经显示，来自大黄(及/^m柳 似flWcm)的白藜芦醇合酶在以肉桂酰辅酶A代替香豆酰辅酶A作为底 物时事实上合成了少量赤松素(Samappito等，2003)。类似地，香豆酰辅酶A连接酶可接受香豆酸和肉桂酸作为底物，尽 管对肉桂酸的催化效率(Km/Kcat)比香豆酸低100倍(Allina等，1998; Ehlting等，1999)。我们由此推断，有可能在由4CL和芪合酶(甚至是 指定为经典白藜,醇合酶的芪合酶)所组成的途径中产生赤松素。近来，公开了一种能从葡萄汁中少量存在的香豆酸产生白藜，醇的 酵母(Becker等2003， ZA200408194)。通过共表达异源辅酶A连接酶基 因(来自杂交白杨)与葡本文档来自技高网...

【技术保护点】
微生物用于产生赤松素的用途，其中所述微生物具有包含至少一种酶活性的有效代谢途径，所述途径从肉桂酸产生赤松素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2006-7-20 0614442.21. 微生物用于产生赤松素的用途，其中所述微生物具有包含至少一种酶活性的有效代谢途径，所述途径从肉桂酸产生赤松素。2. 权利要求l的用途，其中所述微生物产生肉桂酸，并从其产生 赤松素。3. 权利要求2的用途，其中所述赤松素在由以内源性丙二酸单酰 辅酶A为底物的酶所催化的反应中产生。4. 前述权利要求中任一项的用途，其中从肉桂酰辅酶A产生所述 赤松素。5. 权利要求4的用途，其中通过芪合酶从肉桂酰辅酶A产生所述 赤松素。6. 权利要求5的用途，其中所述芪合酶在所述微生物中由编码所 述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物来说不是天然的。7. 权利要求6的用途，其中所述芪合酶为来自以下来源的白藜， 醇合酶(EC 2.3.1.95):属于落花生属(Jmc/i/s)的植物；属于大黄属(及/i^/附)的植物；属于葡萄属(W似或者以下任何属的植物松属 (i^ViMs)、云冲》属(P/cefl)、百合属(丄///附)、桉属(五moi(v/^ws )、爬 山虎属(尸/^mo'sss )、白粉藤属(CVssws )、蝶花百合属(Cfl/oc/^似s )、蓼属(iWj^ M謂)、买麻藤属(GVlC謂)、木菠萝属(v4r似c/77M5 )、假山毛榉属(A^/i( /^is )、刺葵属(尸/^ew/jc)、羊茅属(i^s似ai)、薹草 属(CVimx:)、藜声属(Kem,n/iw)、羊蹄甲属(5flw/w7i/fl)或老虎刺属 (i^m /c 6/M附)。8. 权利要求6的用途，其中所述芪合酶为来自以下来源的赤松素 合酶(EC 2.3.1.146):属于松属(i^iw)的植物，例如欧洲赤松(户. ^/veWn's)'北美乔+》CR so6m)、赤^(A ^wy/oni)、火炬木》(P 属于云杉属(jP/cm)的植物；或者任何桉属(五c/j;/7似s)植物之一。9. 前述权利要求中任一项的用途,其中在所述途径中，在产生氨 的酶催化反应中从L-苯丙氨酸产生所述肉桂酸。10. 权利要求9的用途，其中通过L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)从 L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸。11. 权利要求10的用途，其中所述苯丙氨酸氨裂合酶在所述微生 物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物来说不是天然 的。12. 权利要求ll的用途，其中通过来自以下来源的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC 4.3.1.5)从L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸属于拟南芥属 (Jf6/^/w/s)的植物；属于芸苔属(丑m^/cfl)的植物；属于才甘橘属 (的植物；属于菜豆属(/Viflseo/ws)的植物；属于木>属(Pi7ims) 的植物；属于杨属(i^/m/ws)的植物；属于茄属(5Wflwi/wi)的植物； 属于李属(iVMs)的植物；属于葡萄属(的植物；属于玉蜀黍 属(Ze)的植物；或者属于以下任一属的植物藿香属(J^is似c/^)、凤梨属(JWflMfl51)、 天门冬属(y4s/mrgWS1 )、 布氏兰属(.必fO附/ieflrf/fl )、 簕竹属(5fl附6Sfl )、甜菜属()、桦木属(丑e^m/fl )、黄瓜属(CV/CW附/S1 )、山茶属(Cfl柳e〃/fl )、辣椒属(CVi戸'cw附)、决明属(Owsifl )、 长春花属 ()、鹰嘴豆属(C/cw)、西瓜属(CV>i///ms)、咖^属 (Coj^e)、南瓜属(CwcwW/to )、狗牙才艮属(Q;wo^m )、胡萝卜属 (做CMsO、石斛属(Z)ewafro6/w附)、石竹属(D/薦幼ws)、 洋地黄属 (D&Yfls)、 薯蓣属(/oscomi )、 按属(五wcfl/似s1 )、 GVi〃ws、 银杏 属(G7&0 )、 大豆属(G7戸W )、 大麦属(好onfe薩)、向日葵属 ()、番薯属(化o附oe)、 莴苣属(丄flwcfl)、 紫草属 (丄/^5/ e簡w/m )、 百脉根属(丄o似s)、 番痴属(Z^co /7^*5iam )、 苜蓿 属(Af(^Z/cgo )、苹果属(Af/s )、木薯属(Maw/to )、苜蓿属(Merf/oigo )、 日中花属(M^e附6owiAeww附)、烟草属(7V,V^/wfl )、木犀榄属()、 稻属(Oo^fl )、豌豆属(PZsmw )、鲟梨属(尸ers^！)、欧芽属(户Wn se/iViw附)、 蝴蝶兰属(iV^/e/iopw's )、刚竹属(iV^〃^toc/^s )、小立碗藓属(/^SrO附/^〃fl )、 云杉属(P/c^1)、 梨属(尸jtms)、栎属(jgMem/s)、萝卜属(j fl/;/^聽s )、地黄属(及e/i廳朋iVi )、悬钩子属(勘6tis )、高粱 属(jSWg/rw附)、5^/r^iosWs1、繁缘属()、错笔花属(鄉/osw^s1 )、 小麦属(7WY/cm附)、车轴草属(7>(/i //m i )、 小麦属(7h7/cw附)、越桔 属(Hicc,Vi/w附)、5L豆属(Wg)或百日草属();或者来自曲 霉属(Js/7^^7/ms)的丝状真菌。13. 权利要求10至12中任一项的用途，其中所述PAL接受苯丙 氨酸为底物并由其产生肉桂酸，以使得如果该PAL也接受酪氨酸为底 物并由其形成香豆酸，则所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比值小 于l:l。14. 权利要求13的用途，其中如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化 酶(C4H)，则Kcat(PAL)/Kcat(C4H)比值为至少2:1。15. 前述权利要求中任一项的用途,其中在所述途径中，在ATP 及辅酶A为底物、ADP为产物的酶催化反应中产生所述肉桂酰辅酶A。16. 前述权利要求中任一项的用途，其中在由4-香豆酸辅酶A连 接酶或肉桂酰辅酶A连接酶所催化的反应中形成肉桂酰辅酶A。17. 权利要求16的用途，其中所述4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂 酸辅酶A连接酶是来自以下来源的4-香豆酸辅酶A连接酶/肉桂酸辅酶 A连接酶(EC 6.2.1.12):属于冷杉属(J6/m)的植物，属于拟南芥属(Jm6/^/^/s)的植物，属于芸莒属(丑m^/ai)的植物，属于才甘橘属(Ows )的植物，属于落叶松属()的植物，属于菜豆属() 的植物，属于松属(尸/zis)的植物，属于杨属(iV/^/s)的植物，属 于茄属(5W附)的植物，属于葡萄属(FzY的植物，属于玉蜀黍 属(Zefl)的植物，或者属于以下任一属的植物藿香属(v^Wflc/ie)、 紫穗槐属(Jiwc 77/^)、 4艮杉属(C&j;fl)、雪松属(CWras)、番红花 属(Otfo/s )、羊茅属(i^Wai )、大豆属((7/jc/e )、胡书匕属(/g//w )、 S由才，属(/Te^/eer/a )、 紫草属(丄/^Aos/7er附M附)、，繁、麦草属(丄o/i'u附)、 百脉根属(丄齒5)、番痴属(Z^考^/co)、苹果属(Ma/s)、苜蓿属(iV/^Z/cfl^)、 曰中花属(Afeswij^jflii^挑w附)、烟草属(iWcWflWfl)、 长苞铁杉属(A^/iofegfl)、稻属(6>o^)、天竺葵属(iV/f^m/w/M )、 欧芽属(i^^^se/z7iM柳)、'J、立碗藓属(iV^sco附/^^〃)、云#-属()、 李属(7V簡MS)、金钱松属(/^w^/flr/;c )、黄杉属(J^^tewgfl)、蔷 薇属(及om)、悬钩子属(及h6ms)、及j;z、甘蔗属(5Vicc/iflf7/附)、碱蓬 属(Swflerffl)、盐芥属(T7ie〃Mwg/e〃fl )、小麦属(7Wc謂)或铁杉属(Rgfl);来自属于曲霉属(^s/^^///s)的丝状真菌，属于脉孢霉属(A^inW/70m)的丝状真菌，属于亚罗酵母属(KWTO两'fl)的真菌，属于球腔菌属(A0;aw/7AflwC/fl )属的真菌，属于分4支杆菌属 (聊co6flm'謂)的细菌，属于奈瑟氏菌属(7V、sm'fl )的细菌，属于 链霉菌属(5^印M/i^cm)的细菌，属于红细菌属(及/^^6flw)的细 菌，或来自属于钩口线虫属(^ficj;/^to附fl)的线虫，属于隐杆线虫属 (CewoWm6力Y/s)的线虫，属于血矛线虫属(^Tae附o/ic/ii/s)的线虫, 属于虫丘虫5l属(1w^7'cms)的线虫，属于才艮结线虫属(Afe/^^5Jwe)的 线虫，属于类圆线虫属(iftfY /fgj;/o,V/s)的线虫,或属于/V/WiV Mc/is 属的线虫。18. 前述权利要求中任一项的用途，其中向所述微生物中重组引入 了编码所述代谢途径中相应酶的至少一种遗传序列的至少一个拷贝。19.前述权利要求中任一项的用途，其中编码苯丙氨酸氨裂合酶《 遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。20. 前述权利要求中任一项的用途，其中编码4-香豆酸辅酶A连 接酶或肉桂酸辅酶A连接酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物 中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。21. 前述权利要求中任一项的用途，其中编码白藜芦醇合酶的遗传 序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表 达信号有效连接。22. 前述权利要求中任一项的用途，其中编码赤松素合酶的遗传序 列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达 信号有效连接。23. 权利要求l的用途，其中所述微生物含有与表达信号有效连接 的编码苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝，以及含 有与表达信号有效连接的编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A 连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝，以及含有与表达信号有效 连接的编码白藜，醇合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。24. 权利要求l的用途，其中所述微生物含有与表达信号有效连接 的编码苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝，以及含 有与表达信号有效连接的编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A 连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及含有与表达信号有效 连接的编码赤松素合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。25. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述微生物是真菌。26. 权利要求25的用途，其中所述微生物是丝状真菌。27. 权利要求26的用途，其中所述微生物属于曲霉属。28. 权利要求27的用途，其中所述微生物是黑曲霉(y^/7^^i7/s w/g)或米曲霉的菌林。29. 权利要求25的用途，其中所述微生物是酵母。30. 权利要求29的用途，其中所述微生物属于以下属酵母属 (5Vicc^n 附j^s1 )、 克鲁维酵母属d/m 考ces1 )、 假丝酵母属(CVmrfiV/fl )、毕赤酵母属(朽cA/)、德巴利酵母属(Wa 柳j;c)、汉 逊酵母属(^m^/i/fl)、亚罗酵母属(KinwW)、接合酵母^ (^Vgos^cc/ifln 附yces)'或裂殖酵母属(5c/r/^sttcc^fwiy^s )。31. 权利要求30的用途，其中所述微生物是来自以下的菌林酿 酒酵母(5W c/rtf/o考ces rev/sie )、 A:/wm'、 51. 6a^聽s1、 少抱酵母(乂 ejc/gwws )、 51. sevflOT'、 葡萄汁酵母(51. Mvcrm附)、乳酸克鲁维酵母丝酵母(CVm力V/fl &7/s )、热带假丝酵母(CWn^/cato)、树干毕赤酵母 (P/c/r/ s咖VZ/s )、 巴斯德毕赤酵母(A/7fl加Ws )、尸.sw*Mo/7/r//、汉逊德巴利酵母(2^6 附j;c^y/r/i5wi//)、 多形汉逊酵母(^Tmswim//;o(v柳or/7Afl )、解月旨亚罗酵母(！iwroM^Vi/^w(v,/c)、 鲁氏接合酵母 (Z^osYicc/rfln7附j7c^y iwija7)或粟酒裂殖酵母(iSc/^zos/icc/rfwy;c^sv附6e )。32. 权利要求1至24中任一项的用途，其中所述微生物是细菌。33. 权利要求32的用途，其中所述微生物属于埃希氏菌属 (五sr/renV^,Vi)或乳球菌属(丄flc,ococcM51 )。34. 权利要求33的用途，其中所述微生物是大肠杆菌(￡scAw/c/ Vi co//)或乳酸乳球菌(Z^ic似coccs/fl/s)菌林。35. 编码苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶 A连接酶以及白藜，醇合酶的核苷酸序列的异源表达用以产生赤松素 的用途。36. 编码苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶 A连接酶以及赤松素合酶的核苷酸序列的异源表达用以产生赤松素的 用途。37. —种生产赤松素的方法，其包括在产生赤松素的条件下培养具有 产生赤松素之代谢途径的微生物细胞，其中所述途径包含接受苯丙氨酸为 底物并由其产生肉桂酸的苯丙氨酸氨裂合酶(PAL),所述PAL使得如果 该PAL也接受酪氨酸为底物并由其形成香豆酸，则所述PAL的Km(苯 丙氨酸)/Km(酪氨酸)比小于l:l;并且其中如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化酶(C4H),则Kcat(PAL)/Kcat(C4H)为至少2:1。38. 权利要求37的方法，还包括分离由此产生的赤松素。39. 权利要求37或38的方法，其中所述培养在基本不存在肉桂酸 或其衍生物的外部来源的情况下进行。40. 权利要求37至39中任一项的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔卡茨，约亨福斯特，黑尔佳大卫，汉斯彼得施密特，马林森德柳斯，萨拉彼得森比约恩，托马斯托马森杜尔许斯，
申请(专利权)人：弗卢克索姆科学公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]