在转基因植物中增加抗大豆锈病抗性的方法技术

本发明专利技术涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加对大豆锈病的抗性的 方法，以及涉及核酸分子用于产生这些植物和/或植物细胞的用途。在这些 植物中，与野生型相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性改变。此 外，本发明专利技术涉及具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物和/或植物细胞， 以及包含下述序列的表达载体，所述序列与编码功能性或非功能性MLO 或其片段的序列同一、同源或互补。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方 法，以及用于核酸分子产生这些植物和/或植物细胞的用途。在这些植物中，与野生型植物相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性被改变。此夕卜， 本专利技术涉及具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物和/或植物细胞，以及 包含下述序列的表达载体，所述序列与编码功能性或非功能性MLO或其 片段的序列同一、同源或互补。植物普遍遭遇致病微生物。由多种病原体如病毒、细菌和真菌引起的 植物疾病可以导致栽培植物的生长中显著的作物损失，一方面是经济后果， 另一方面还引起对人食品的安全性威胁。从上个世纪开始已经使用了化学 杀真菌剂来控制真菌疾病。尽管使用这些物质使得植物疾病程度减少，但 是直到现在还不能排除这些化合物是否对人、动物和环境具有有害作用。 为了将常规杀虫剂的使用减到最小，因此重要的是检查多种植物对于不同 的病原体的天然病原体防御，并且除了经典的培育方法外，系统性使用遗 传工程(例如通过引入外部抗性基因或通过操作植物中内源基因表达)以 产生病原体抗性植物。抗性通常意思是植物防止或至少是减少有害病原体侵染和建群的能 力。在天然存在的抗性中可以辨别出不同的机制，应用所述机制植物抵御 致植物病生物的建群。病原体和宿主之间这些特异性的相互作用确定了感 染过程(Schopfer和Brennicke (1999) Pflanze叩hysiologie， Springer Verlag， Berlin-Heidelberg,德国)。在品种特异性抗性(也称为宿主抗性)方面，相容和不相容相互作用 之间有差异。在相容相互作用中，在强毒病原体和易感植物之间发生相互 作用。病原体生存并且可以建立繁殖结构，而同时宿主死亡。另一方面，13当病原体感染植物但是在弱的症状a之前或之后其生长^皮抑制时，不相容相互作用发生。在后一种情形中，植物对各个病原体有抗性(Schopfer 和Brennick,见上)。在相容和不相斜目互作用中，发生了宿主对病原体 的防御和特异性反应。但是，在大自然中，由于病原体迅速的进化t艮，这一宿主抗性通常 被克服(Neu等人(2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 No. 7: 626-633)。与此相比，非宿主抗性提供了强的、广泛的和持久的对植物病 原菌的保护。非宿主抗性意思是这样的现象，即病原体可以在某些植物物 种中诱导疾病，但是在其他植物物种中不诱导(Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259-264)。除了这一有意思的特征外，迄今为止对于非宿主抗性的遗传和分子生 物学基础理解的纟艮少。存在这样的指示，即非宿主抗性是由不确定的物质 诱导的，而且单个病原体蛋白质诱导非宿主抗性反应(Heath (1981) Phytopathology 71: 1121-1123; Heath (2001) Physiol. Mol. Plant Pathol. 58: 53-54; Kamoun等人(1998) Plant Cell 10: 1413-1425; Lauge等人(2000) Plant丄23: 735-745; Whalen等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6743-6747 )。非宿主抗性的现象也可以;L基于植物物种的结构或化学性质， 例如角质层的厚度或抑制性物质的存在。除了基于形成的物理屏障的抗性外，植物最有效的非宿主防御系统是 由保守的分子微生物结构的识别所代表的，这也被称为PAMP (病原体相 关性分子图式)。由PAMP-受体识别PAMP触发了导致多个抗性机制活化 的信号级联^L大，所述抗性机制包括细胞壁强化、毒性化合物分泌和程序 性细胞死亡。这些防御机制足够有效地停止大多数微生物尝试的袭击。这完整部分。仅有一些病原体物种进化出了特异性机制来避免或阻断单个植物物种 的基础防御系统，并且因此成为这些物种的病原体。可以想象这些物种特 异性防御破坏的关键步骤是靶向和操作特定的宿主蛋白质。白粉病是许多单子叶植物和双子叶植物(如甜菜、多种谷类、黄瓜、 莴苣、胡萝卜、豌豆、番茄，草莓，苹果，葡萄等)的普通真菌疾病。白粉病菌(白粉菌目(Erysiphales))属于子囊菌门(Ascomycota )。禾本科 布氏白粉菌(Blumeriagraminis)是引起草类中白粉病的真菌。大麦白粉 病真菌(禾本科布氏白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp. hordei， Bgh ))是攻击大麦(T/onsfewM vw/gfl^ L.)表皮细胞的专性活体营养病原 体。在将孢子与大麦叶的角质层相接触后，形成了附着器。真菌侵袭的下 一关键步骤是细胞壁的穿入，接着是被称为吸器的特化的细胞内摄食结 构的建立(不破坏质膜的完整性)。在单子叶植物大麦中，七螺旋质膜定位的MLO蛋白质家族同种型的 存在是白粉病菌成功侵入宿主细胞壁所需要的。缺乏这些MLO蛋白质(由 于天然遗传变异或者在各个附/o基因中经诱导的损伤引起的)导致真菌孢 子不能穿过植物细胞壁。缺乏功能性附/o基因的所有大麦基因型对于所有 已知的大麦白粉菌的分离群是有抗性的。此外，在田地条件下，隐形遗传 的mlo抗性是非常持久的。在过去的25年中，已经在大多数欧洲春季大 麦品种中使用mlo突变。MLO蛋白质是必需的质膜定位的蛋白质并且包含7个疏水跨膜结构 域。细胞质C-末端具有两亲性a-螺旋，其作用为钙调蛋白结合结构域，这 对于MLO蛋白质的完全活性是必需的。在体外和体内都显示了与这一肽 结构域的钩-依赖性钙调蛋白结合，所述结合贡献了大约一半的mlo的易感 性-赋予的活性(KimM.C. Nature. 2002 Mar 28;416(6879):447-51 )。当被突变时会阻抑mlo-介导的抗性的基因fw2 6wto拔^2摩;f的J 被发现编码质膜-停留的突触融合蛋白，所述突触融合蛋白是属于SNARE 蛋白质超家族的蛋白质。缺乏野生型ROR2部分损害了 mlo基因型中的穿 入抗性，表明突触融合蛋白活性是有效的mlo抗性所需的 (Freialdenhoven A. Plant Cell. 1996 Jan;8(l):5-14 ) 。 MLO和ROR2似 乎都在尝试的真菌细胞壁侵入位点处主要聚集。因此，看起来MLO和 ROR2在生物胁迫的位点处形成新的病原体触发的微域(Bhat R.A. Proc.15Natl. Acad. Sci. USA. 2005 2月22;102(8):3135-40 )。在这些亚细胞区域中， 在成功的真菌宿主细胞侵袭过程中，MLO和细胞质钙传感器钓调蛋白之 间的相互作用瞬时增加(BhatR.A.，见上)。此外，显示了 MLO和ROR2 之间的直接的物理相互作用。在单氨基酸取代mlo突变蛋白质的子集和野 生型ROR2之间，以及在野生型MLO和由大麦ror2突变体所编码的大麦 变体之间这一相互作用的强度被强烈降低。MLO可以在质膜处调节 SNARE蛋白质依赖性和小泡转运相关的过程。因此，白粉病菌似乎特异 性地破坏MLO来调节植物细本文档来自技高网...

【技术保护点】
在转基因植物和／或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方法，其特征在于与野生型植物或植物细胞相比，至少一种ＭＬＯ蛋白质的含量和／或活性分别被改变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.8.10 EP 06118753.01. 在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方法，其特征在于与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性分别被改变。2. 根据权利要求l的方法，其特征在于与野生型相比，至少一种内源 MLO的含量和/或活性减少。3. 根据权利要求2的方法，其特征在于通过向植物细胞转移至少一种 核酸分子来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述核酸分子包含 至少一种序列，所述序列与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或 互补。4. 根据权利要求3的方法，其特征在于与编码内源MLO或其片段的 序列同一、同源或互补的经转移的核酸分子的部分包含20至1000个核苷 酸，优选20至750个核苷酸、更优选20至500个核苷酸、尤其优选20 至250个核普酸、特别优选20至150个核苷酸，也特别优选20至100个 核普酸，以及最优选大约20至50个核苷酸。5. 根据权利要求3或4的方法，其特征在于经转移的核酸分子的一部 分与编码内源MLO或其片段的序列至少50%、优选至少60%、更优选至 少70%、尤其优选至少80%、特别优选至少90%、以及最优选至少95% 同源。6. 根据权利要求3或4的方法，其特征在于经转移的核酸分子的一部 分与编码内源MLO或其片段的序列有至少50%、优选至少60%、更优选 至少70%、尤其优选至少80%、特别优选至少卯％，以及最优选至少95% 互补。7. 根据权利要求3至6中任一项的方法，其特征在于至少一种内源 MLO的含量和/或活性的减少是通过RNA干扰(RNAi)、反义构建体、 共-阻抑构建体、转录后基因沉默(PTGS)、核糖核酸酶P构建体、同源 重组、核酶构建体或病毒诱导性基因沉默(VIGS)实现的。8. 根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件 -在植物中有功能性活性的启动子序列，-与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的序列互补的反义 序列，或这一反义序列的同源物，其中所述序列在其3，端具有可为剪接体 所识别的3，外显子序列，_与其有效连接的内含子，-与其有效连接的正义序列，所述正义序列与编码至少一种MLO或 其片段的序列同 一或同源，其中所述序列在其5，端具有可为剪接体所识别 的5，外显子序列，-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a)的所述载体转移到植物细胞中，以及任选地整合进 植物基因组。9. 根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建双链RNA分子，其具有15至100个核苷酸，优选20至75个核苷 酸，更优选20至50个核苷酸，尤其优选20至40个核苷酸，特别优选20至30 个核苷酸以及最优选20至25个或者21、 22或23个核苷酸的长度，包含具有 正义链的核,列，所述正义链与编码至少一种内源MLO的序列的片段同 一或同源，b) 将来自步骤a)的分子转移到植物细胞中。10. 根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤a)构建载体，所述载体以5，-3，方向包含下列核酸序列元件 -在植物中有功能性活性的启动子序列，-与其有效连接的与编码至少一种内源MLO或其片段的序列互补的 反义序列，或这一反义序列的同源物，-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b)将来自步骤a)的所述载体转移到植物细胞中，以及任选地整合进 植物基因组。11. 根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，所述栽体以5，-3，方向包含下列核酸序列元件 -在植物中有功能性活性的启动子序列，-与其有效连接的正义序列，所述正义序列与编码至少一种内源 MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列具有自身-互补的区域， -任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a)的栽体转移到植物细胞中并且任选地整合进植物基 因组中。12. 4艮据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件- 在植物中有功能性活性的启动子序列，- 与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的mRNA的序列 互补的DNA序列，- 与其有效连接的编码核糖核酸酶P的序列，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a )的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基 因组。13. 根据权利要求3至7中任一项的方法， 其特征在于其包括下列步骤a)构建栽体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件- 与编码至少一种内源MLO的5'端的序列同一或同源的DNA序列，- 在植物中有功能性活性的启动子序列，_ 与其有效连接的编码抗性基因或报道基因的DNA序列，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，- 与编码至少一种内源MLO的3'端的序列同一或同源的DNA序列，b) 将来自步骤a )的栽体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基 因组。14. 根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件- 在植物中有功能性活性的启动子序列，- 与其有效连接的编码特异性识别至少一种内源MLO的mRNA的 核酶的DNA序列，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a )的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基 因组。15. 根据权利要求2的方法，其特征在于通#达至少一种非功能性 MLO或其片段来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述非功能 性MLO或其片段具有至少一处点突变、缺失和/或插入。16. 根据权利要求15的方法，其特征在于非功能性MLO的至少一处 点突变、缺失和/或插入阻止了 MLO的细胞功能，尤其抑制了MLO与其 病原或生理性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和Z或钙调蛋白的相互作用。17. 根据权利要求15或16的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件- 在植物中有功能性活性的启动子序列，- 与其有效连接的编码至少一种内源MLO的显性失活突变体的 DINA序列，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a )的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基 因组。18. 根据权利要求2的方法，其特征在于通it^达至少一种重组抗体 来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述重组抗体对于至少一种 内源MLO来说是特异性的，并且其阻止MLO的细胞功能，并且其尤其 抑制MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和/或钓调蛋 白的相互作用。19. 根据权利要求18的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件- 在植物中有功能性活性的启动子序列，- 与其有效连接的编码重组抗体的DNA序列，所述重组抗体对于 至少一种内源MLO来说是特异性的并且其阻止MLO的细胞功能，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a )的栽体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。20. 根据权利要求2的方法，其特征在于通过表达至少一种MLO抑 制剂来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述MLO抑制剂阻止 了至少一种MLO的细胞功能，并且其尤其抑制了 MLO与其病原或生理 性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和/或钙调蛋白的相互作用。21. 根据权利要求20的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建载体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件 - 在植物中有功能性活性的启动子序列，- 与其有效连接的编码MLO抑制剂的DNA序列，所述MLO抑 制剂阻止了 MLO的细胞功能，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a )的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基 因组。22. 根据权利要求1的方法，其特征在于与野生型相比至少一种MLO 的含量和/或活性#皮增加。23. 根据权利要求22的方法，其特征在于通过向植物或植物细胞转移至少一种核酸分子来增加至少一种MLO的含量和/或活性，所述核酸分子 编码至少一种MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物。24. 根据权利要求22或23的方法，其特征在于其包括下列步骤a) 构建栽体，其以5，-3，方向包含下列核酸序列元件- 在植物中有功能性活性的启动子序列，- 与其有效连接的编码至少一种MLO和/或其功能等价的片段和/ 或其功能等价的衍生物的DNA序列，- 任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，b) 将来自步骤a )的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基 因组。25. 根据权利要求22至24中任一项的方法，其特征在于通过影响内 源MLO的转录、翻译和/或翻译后修饰来增加至少一种内源MLO的含量 和/或活性。26. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于MLO是植物MLO, 优选选自下述的植物MLO:大麦(//w^m附vw/gfr) MLO、稻(6^yw /wi )MLO、鼠耳芥(麵/w ) MLO，优选A麵ol 、 AtMIo2、 AtMlo3、 AtMlo4、 AtMlo5、 AtMlo6、 AtMlo7、 AtMlo8、 AtMlo9、 AtMlolO、 AtMloll、 AtMlol2、 AtMlol3、 AtMlol4或AtMlol5，亚麻(m附 仏s/tori&w附M附)MLO、普通'J、麦(7V/ricw附e^/vw附)('J、麦)MLO、大豆)Mlo，优选GmMIol、 GmMIo2、 GmMIo3.1或GmMlo3.2， 或与任一所述MLO蛋白质基本功能等价的MLO。27. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于MLO选自具有 如SEQII)NO:2、 4、 7、 9、 11、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46和48中任何所示的^J^^^列的MLO， 或者具有与在SEQID NO:2、 4、 7、 9、 11、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46和48中所示的任何MLO 序...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·弗兰克，H·舒尔塞斯，C·赫费尔，
申请(专利权)人：巴斯福植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE