本发明专利技术提供了改良蛋白质生产的方法和组合物。方法包括步骤：（ａ）将第一核酸序列引入宿主细胞，所述第一核酸序列包括与所需的蛋白质序列有效连接的信号序列；（ｂ）表达第一核酸序列；（ｃ）共表达编码分子伴侣或折叠酶的第二核酸序列，所述分子伴侣或折叠酶选自ｂｉｐ１、ｅｒｏ１、ｐｄｉ１、ｔｉｇ１、ｐｒｐ１、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、钙联接蛋白和ｌｈｓ１；和（ｄ）收集从宿主细胞分泌的所需蛋白质。第一核酸序列任选的包括在信号序列和所需的蛋白质序列之间的酶序列。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术提供了改良蛋白质生产的方法和组合物。在一些实施方案中，本文提供的 方法涉及与蛋白质有效连接的信号序列的用途。在一些实施方案中，与蛋白质有效连接的 信号序列在宿主细胞中与至少一种分子伴侣组合表达。在一些实施方案中，蛋白质在丝状 真菌细胞中表达。在其他实施方案中，本专利技术的方法涉及蛋白质与酶的催化结构域的融合， 所述酶例如葡糖淀粉酶或CBHl。一些实施方案提供了信号序列、一个或多个分子伴侣、陪伴 蛋白和/或折叠酶的组合，和/或蛋白质与催化蛋白质或结构域的融合。
技术介绍
宿主细胞例如酵母、丝状真菌和细菌已长期用于表达盒分泌外源蛋白质。通常，这 些外源或蛋白质在酵母、丝状真菌和细菌中的生产，涉及表达蛋白质以及从宿主细胞或生 长细胞的培养基中部分或完全纯化蛋白质。尽管一些蛋白质需要从宿主细胞的胞内环境中 纯化，如果蛋白质从细胞分泌到培养基中，则可以极大的简化纯化。胞外蛋白质分泌是复杂的，也是多种细胞表达系统中蛋白质生产的重要方面。与 蛋白质分泌相关的一个因素是正确的蛋白质折叠。在体外稀释浓度下，许多蛋白质可以可 逆的解折叠和再折叠，因为指定紧密折叠结构所需要的全部信息都存在于蛋白质的氨基酸 序列中。然而，体内的蛋白质折叠发生在浓缩的大量蛋白质的环境下，其中分子内的折叠过 程与分子间的聚集反应相互竞争。这些复杂因素在真核表达系统中比在原核系统中更显著.真核分泌通路的第一步是新生多肽以伸展的形式跨内质网(ER)膜的易位。多肽 的正确折叠和装配通过分泌通路发生在ER中。然而，在多种情况下，虽然蛋白质大量过表 达，但却分泌不佳。实际上，在多种情况下，应该有利于此类表达的分泌信号没有表现出实 现所述功能。与其他蛋白质的相互作用使所需蛋白质的表达更加复杂化。当在一个物种、属 或科中尝试表达从另一物种、属或科的生物中获得的蛋白质时，上述因素甚至更加重要。例 如，担子菌(Basidiomycete)蛋白质(例如，漆酶)通常在子囊菌(Ascomycete)宿主(例 如，木霉属(Trichoderma))中表达低下。实际上，尽管在真菌表达系统领域开展了大量工 作，但仍然需要改良所需蛋白质的胞外表达。专利技术概述专利技术提供了改良蛋白质生产的方法和组合物。方法涉及使用与所需蛋白质有效连 接的信号序列，所述蛋白质在宿主细胞中与至少一种分子伴侣组合表达。在一些实施方案 中，在丝状真菌细胞中表达蛋白质。在其他实施方案中，本专利技术的方法涉及所需蛋白质与宿 主蛋白质，例如葡糖淀粉酶或CBHl催化结构域的融合。在一些实施方案中，本专利技术提供了增加丝状真菌宿主(例如，子囊菌)中的蛋白质 生产的方法和组合物，通过组合分泌信号的应用和分子伴侣蛋白的表达，所述分子伴侣蛋 白是从与蛋白质相同的生物体中获得的。在一些实施方案中，蛋白质是非子囊菌蛋白质，其 与来自子囊菌宿主蛋白质的分泌信号融合。在其他一些实施方案中，至少一种分子伴侣蛋白可用于增加与子囊菌蛋白质的催化结构域融合的蛋白质的表达。一些实施方案提供了用于在子囊菌宿主细胞中生产至少一种蛋白质的方法，通过 向宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括与来自和宿主相同的门、属和/或物种的信 号序列有效连接的所需蛋白质；共表达来自与蛋白质相同的门、属和/或物种的分子伴侣； 在适合蛋白质表达和生产的培养条件下培养宿主细胞；并生产蛋白质。方法任选的包括回 收所产生的蛋白质。一些实施方案包括将蛋白质与来自子囊菌的酶的催化结构域融合。其 它实施方案包括将蛋白质与来自子囊菌的全长的酶融合。在一些实施方案中，子囊菌宿主 细胞是木霉属。在一些实施方案中，分子伴侣是下列中的至少一种BIP1、ER01、PDI1、TIG1、 PRPl、PPIl、PPI2、PRP3、PRP4、钙联接蛋白和 LHSl。蛋白质的选择不限于，并可以包括来自任何属、物种和/或科的任何下列蛋白质 漆酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、颗粒淀粉水解酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、半纤 维素酶、蛋白酶、氧化酶、漆酶及其组合。一些实施方案包括来自NSP24或CBHl基因的信号 序列。在一些实施方案中，分子伴侣基因是bipl。方法的实施方案还可以包括子囊菌启动 子。在一些实施方案中，宿主细胞和信号序列来自相同的子囊菌宿主。在一些实施方案中， 启动子是来自木霉属的CBHl启动子。在一些实施方案中，蛋白质是担子菌蛋白质。在一些 实施方案中，宿主细胞是子囊菌宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是担子菌宿主细胞 且蛋白质是子囊菌蛋白质。其它一些实施方案提供了用于在子囊菌宿主细胞中生产至少一种蛋白质的方法， 通过向子囊菌宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括与来自子囊菌的酶的催化结构域 融合的所需蛋白质，其中所需蛋白质是担子菌蛋白质；共表达子囊菌的分子伴侣；在适合 蛋白质表达和生产的培养条件下培养子囊菌宿主细胞；并生产蛋白质。在一些实施方案中， 回收所产生的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质与子囊菌信号序列有效的连接。附图简介附图说明图1显示了木霉属表达质粒pTrex4-漆酶D opt的示意图。多核苷酸序列显示为 SEQ ID NO 1。图2显示了木霉属表达质粒pTreX2g-Bipl的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO :2。图3显示了木霉属表达质粒pTrex2g-Pdil的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO :3。图4显示了在木霉属表达质粒pTreX2g-Erol中使用的Erol序列的示意图。多核 苷酸序列显示为SEQ ID NO :4ο图5显示了木霉属表达质粒pTrGA-漆酶D opt的示意图。多核苷酸序列显示为 SEQ ID NO :5。图6显示了木霉属表达质粒PKB408的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO 6。图7显示了木霉属表达质粒PKB410的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO 7。图8-1至8-4显示了里氏木霉NSP24可读框(ORF)SEQ ID NO :8。信号肽是前20个氨基酸(SEQ ID NO 9)。图9-1至9-2显示了里氏木霉CBHl ORF (SEQ ID N0:10)。信号肽开始于碱基对 210，结束于碱基对260 (SEQ ID NO :11)。催化核心开始于碱基对261至碱基对1698 (SEQ ID NO: 12)，包括内含子1(从碱基对671至737)和内含子2 (从碱基对1435至1497)。接 头序列始于碱基对1699，止于碱基对1770 (SEQ ID N0:13)。CBHl蛋白质序列显示为SEQID NO :14。图10示例了漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌(c. unicolor)漆酶的编 码基因和全长木霉属葡糖淀粉酶。菌株#8-2是CBHl漆酶融合体。菌株1066-9、1066-13 和1066-15是TrGA漆酶融合体。图11示例了在摇瓶中漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌(C. unicolor) 漆酶的编码基因和CBHl或NSP24信号序列。Y轴以单位/ml显示了漆酶活性。X轴显示了 菌株(仅CBH融合体，或具有信号序列)。图12示例了在发酵罐中漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌漆酶的编码 基因和CBHl或NSP24信号序列。Y轴以单位/ml显示了漆酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
生产所需蛋白质的方法，其包括步骤：（ａ）将第一核酸序列引入宿主细胞，所述第一核酸序列包括与所需的蛋白质序列有效连接的信号序列；（ｂ）表达第一核酸序列；（ｃ）共表达编码分子伴侣或折叠酶的第二核酸序列，所述分子伴侣或折叠酶选自ｂｉｐ１、ｅｒｏ１、ｐｄｉ１、ｔｉｇ１、ｐｒｐ１、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、钙联接蛋白和ｌｈｓ１；和（ｄ）收集从宿主细胞分泌的所需的蛋白质。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍锴，王华明，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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