相思子毒素Ａ链突变体的构建及作为候选疫苗抗原制造技术

本发明专利技术公开了一种与相思子毒素疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的蛋白质，命名为ｍＡＴＡ，是如下１）或２）中任一所述的蛋白质：１）由序列表中的序列２的氨基酸残基序列组成的蛋白质；２）将序列表中的序列２氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的由１）衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，经过点突变获得的突变体ｍＡＴＡ，是通过重组表达得到的相思子毒素Ａ链突变体蛋白，经过检测，其具有低毒性、无血管渗漏、有良好免疫原性等特点，可以作为候选疫苗抗原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种相思子毒素A链突变体的构建及作为候选疫苗抗原，尤其涉及一 种与相思子毒素疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
随着生物技术的快速发展和生物毒素的开发利用，毒素在大规模杀伤性武器中的 重要性已凸现出来，生物毒素及其生物恐怖的威胁与日俱增。相思子毒素是由A、B链组成， A链为效应链，具有RNA N-糖苷酶活性，B链为结合链，介导A链进入细胞内发挥毒性作用。 不同产地的相思子含有在一级结构上稍有差异的相思子毒素，表现为其毒性大小有差异， 文献报道的相思子毒素小鼠腹腔LD5tl介于4-20 μ g/kg之间。生产原料相思籽来源广泛，容 易获得，在许多公开的专业刊物和互联网上又可轻易得到如何提取制备相思子毒素的详细 资料，所以，相思子毒素的恐怖威胁不容忽视。针对相思子毒素中毒，目前尚无预防疫苗、特 异性抗毒素和解毒药。通过分析现有的研究进展和成果，美军的生防专家认为，疫苗研究是 对抗其中毒的有效预防手段。因此，开展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的军事和社^^ 眉、ο我国学者对相思子毒素生物战剂的侦检和医学防护等研究领域刚刚起步，针对相 思子毒素的恐怖袭击尚无配套诊断试剂和有效免疫治疗及防护手段，因此迫切需要建立和 发展具有自主知识产权的检测和防护用品。为了防止敌对势力和恐怖组织使用相思子毒素 等生物战剂的袭击，应尽快建立和完善相思子毒素等生物战剂的侦检和医学防护系统，保 证及时采取应急措施和对策，将生物恐怖袭击造成的破坏降低到最低限度。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种与相思子毒素疫苗相关蛋白及其编码基因。本专利技术提供的蛋白质，命名为mATA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。上述序列表中的序列2由251个氨基酸残基组成。所述一个或数几个氨基酸残基 的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。mATA的编码基因mATA也是本专利技术保护的范围，为如下1) _3)中任一所述的DNA分 子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述序列表中的序列1由753个核苷酸组成，编码区为序列1自5’末端第1_753 位核苷酸。含有所述蛋白质的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本 专利技术保护的范围。所述重组载体为将所述编码基因插入载体pET-His的EcoR I和Nhe I识别位点 间得到的重组载体。所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌得到的重组菌。扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也是本专利技术保护的范围，所述引物对 的一条引物为序列3所示的DNA分子，另一条引物为序列4所示的DNA分子。本专利技术的另一个目的是提供一种疫苗，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种 1)所述的蛋白质；幻所述的重组载体；幻所述的重组菌。所述蛋白质在制备疫苗中的应用也是本专利技术保护的范围；所述编码基因在制备疫 苗中的应用也是本专利技术保护的范围；所述重组载体在制备疫苗中的应用也是本专利技术保护的 范围；所述重组菌在制备疫苗中的应用也是本专利技术保护的范围。所述疫苗为相思子毒素疫苗，具体为相思子毒素A链突变体疫苗。本专利技术的实验证明，经过点突变获得的突变体mATA，是通过重组表达得到的相思 子毒素A链突变体蛋白，通过A链突变体免疫原的免疫途径、剂量、次数、佐剂等多种不同免 疫方案，分析相思子毒素A链突变体的免疫保护效果，结果为该突变体具有低毒性、无血管 渗漏、有良好免疫原性等特点，可以作为候选疫苗抗原。附图说明图1为相思子毒素A链突变体纯化2为相思子毒素A链突变体的SDS-PAGE电泳3为BCA法测定蛋白浓度标准曲线图4为相思子毒素A链突变体对人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用曲线图5为相思子毒素A链突变体对骨髓瘤细胞Sp2/0的杀伤作用曲线图6为mATA体内中和实验体重变化图7为mATA体外中和实验体重变化具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1、突变体mATA的获得1、突变体mATA的获得根据已有的相思子毒素的A链基因(rATA)序列(rATA核苷酸序列为序列5， rATA MSSIj^^lJ^j^^lJ 6), Quickchange Lighting Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 公司，Catalog#210518)进行定点突变获得突变体 mATA_E164AR167L(质 粒)，经测序，mATA-E164AR167L含有的基因命名为mATA，其核苷酸序列为序列表中的序列 1，编码区为序列表中序列1的自5’末端第1-753位核苷酸序列；mATA编码的蛋白mATA的氨基酸序列为序列表中的序列2所示的序列。应用Lasergene软件预测所构建的突变体的 抗原性未发生明显变化。测序验证突变结果，具体如下将序列5的第491位的碱基A突变为序列1第491位的碱基C，序列5第500位的 碱基G突变为序列1第500位的碱基T。将序列6的第164位氨基酸谷氨酸(E)突变为序列2的第164位氨基酸丙氨酸 (A)，序列6的第167位氨基酸精氨酸(R)突变为序列2的第167位氨基酸亮氨酸(L)。设计引物1. ABRaA Upper :5’ -GGAATTCGAAGATCGCCCGATCAAATTTTCCACCGAAGGTGCCAC-3’(EcoR I)(序列 3)2. ABRaA Lower :5，-GGCTAGCATTCGGCGGATTGCAGACAAACAGCATCAGTGCCAGAACTGC-3’(Nhe I)(序列 4)以上述获得的突变体质粒mATA-E164AR167L作为模板，用引物ABRaA Upper和 ABRaA Lower进行扩增，获得的PCR产物连接至克隆载体pMDIS-T (宝生物工程(大连)有 限公司，产品目录号D101B)得到pMD18T-mATA(也可人工合成序列1，连接到pMD18_T得到 pMD18T-mATA。)，再用 EcoR I (NEB 公司，R0101V)和 Nhe I (NEB 公司，R0131V)双酶切 pMD18T-mATA后回收小片段，与经过同样酶切的表达载体pET-His (孙嗣梅，王景林等.重 组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析.中国生物工程杂志.2005，25 ) 47-51.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)的载体片 段连接，得到的连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(北京全式金生物技术有限公司， 产品目录号D30619)，经筛选后的阳性菌，提取质粒后测序，结果为该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下１）或２）中任一所述的蛋白质：１）由序列表中的序列２的氨基酸残基序列组成的蛋白质；２）将序列表中的序列２氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的由１）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王景林，韩艳辉，高姗，康琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]