针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体制造技术

一种针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体和多肽，其具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：１所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，本发明专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质（水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等）更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单域抗体技术(又称为纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别 是涉及针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DeoXynivalenol，D0N)的单域抗体或多肽。
技术介绍
单域抗体是指仅由普通抗体可变区(VH或VL)组成的基因工程抗体。单 域重链抗体(又称为纳米抗体，VHH抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指仅由重链抗体(Heavy-chain antibodies)可变区(Variable region)组成的基因工程抗体，其中，重链抗体(Heavy-chain antibodies)是一种存在于 骆驼、鲨鱼等动物中天然缺失轻链的抗体。单域抗体和单域重链抗体都具有分子量小、渗透 性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素(vomitoxin，VT)，属 于单端孢霉烯族真菌毒素，主要是由某些镰刀菌产生。该毒素常出现于谷物及其加工产品 中，许多国家和地区都检测到了 DON的污染。DON会引起动物增重下降、食欲减退、营养吸收 率降低，并影响免疫功能。大部分国家对食品、谷物、饲料中的DON含量都做了严格规定。目前，已有针对DON的多克隆抗体、单克隆抗体的公开报道。与单域重链抗体相 比，这些抗体存在生产成本相对较高，制备过程繁琐等缺点。单域抗体具备分子量小、渗透 性好等性质，显示出广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体(包括含有所述单域 抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽)及其氨基酸序列，可以被用于制备检测或抑制 DON污染的试剂和工具。本专利技术提供一种针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体，具有SEQ ID NO. :1所示的 氨基酸序列，其氨基酸序列的IMGT编号和结构域的划分如图1所示。本专利技术所提供的单域抗体包括4个框架区(Framework region,FR)和三个互补决 定区(Complementarity-determining region，CDR)，其中，框架区(FR1-FR4)分别选自 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :4 禾P SEQ ID NO. :5，互补决定区(CDR1-CDR3)分别 选自SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8。互补决定区主要负责抗原的识别，框 架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。本专利技术提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含SEQ ID N0. :2，SEQ ID N0. :3， SEQID NO. :4和SEQ ID NO. :5中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸 序列具有90%同源性。本专利技术提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含SEQ ID N0. :6，SEQ ID NO. :7和 SEQ ID NO. :8中的一个或者两个以上的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有80%同 源性。本专利技术还提供了一种核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO. :1，SEQ ID NO. :2， SEQID NO. 3, SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :5，SEQ ID NO. :6，SEQ ID NO. :7 禾口 SEQ IDN0. 8，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达 以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细 胞，植物细胞，或无细胞表达系统。本专利技术还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸 序列可以根据不同的应用目的而不同。本专利技术还提供一种宿主细胞，包含所述蛋白质或多肽的表达载体。本专利技术还提供了一种净化或检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，其特征是含有上述 蛋白质或多肽。基于本专利技术提供的蛋白质或多肽与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异性结合的能 力，建立脱氧雪腐镰刀菌烯醇的净化或检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，焚光免疫法(Fluoroimmunoassay, FIA)， 免疫芯片法和亲和层析法。本专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造， 能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用 于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。例如将FR2中的V42、G49、P50和W52分别替换为F42、 E49、R50和G52，可得到具有更好的溶解性和稳定性的重链抗体化突变体。本专利技术中所叙述的一些术语具有如下含义同源性描述两个或更多氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨 基酸序列之间同源性的百分比可以通过第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置 处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量除以第一个氨基酸序列中氨基酸总数再乘以100%来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一 氨基酸相比)被认为是有差别。备选地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的 计算机运算程序如NCBI Blast获得。结构域蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。IMGT Ι :IMGT(The International ImMunoGeneTics Database) ψ ^ 一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenmarm， F. , Q. Kaas, et al. (2010). “ IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign :a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. “ Nucleic Acids Res 38 (Database issue) :D301-307. Lefranc, M. P.， C. Pommie, et al. (2003). " IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-Iike domains. " Dev Comp Immunol 27(1) :55-77.)中的描述。密码子(codon)又称为三联体密码(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核 苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。附图说明图1氨基酸编号及结构域示意图。图2间接phage-ELISA法测定噬菌体结合活性。纵坐标表示ELISA读数计测定 450nm处吸光度值，横坐标表示按照表1加样，其中1表示实验组，2表示背景对照，3表示空 白对照a，4表示空白对照b。图3噬菌粒pHEN-D0NIV2结构图。图4表达质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单域抗体，其具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：１所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，由４个框架区和３个互补决定区组成，其中，４个框架区分别由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：４和ＳＥＱＩＤ　ＮＯ．：５组成，３个互补决定区分别由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：７和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：８组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：涂追，许杨，付金衡，陶勇，何庆华，刘夏，
申请(专利权)人：南昌大佳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]