一种针对EGFP标签的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程抗体技术，具体为针对EGFP标签的单域重链抗体，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的一种针对EGFP纳米抗体能够良好地特异性结合绿色荧光蛋白，可应用于检测抗体、富集纯化目的蛋白、靶向纳米材料等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种针对EGFP标签的纳米抗体及其应用
本专利技术涉及基因工程抗体技术，特别是针对增强型绿色荧光蛋白单域重链抗体及其应用。
技术介绍
1962年Shimomure等人首次从维多利亚多管发光水母分离出分子量约为27KD的绿色荧光蛋白，其晶体结构显示，它由11个β-折叠链形成一个β桶状结构，两端被短段的a螺旋所覆盖，发色团位于中心同轴的a螺旋上并与α-螺旋通过共价键连接，β桶和α-螺旋形成致密的结构域，完全包裹发色团，阻止其它蛋白进入发色团并使其不受溶剂猝灭效应的影响，因此，其发光性质稳定，热稳定性好，对一些还原剂、氧化剂、有机溶剂甚至蛋白酶等具有显著抗性。绿色荧光蛋白作为当前生命科学研究中最常用的工具蛋白，具有很高的研究与应用价值。还因其自主发光无毒性等特点，在分子标记和示踪成像技术方面有着独特优势。作为已知的具有最小结合活性的纳米抗体，只有天然的重链可变区区域，与传统的抗体相比，其分子量较小，约为15KD；具有稳定可溶、易表达、免疫原性低、能够很好的识别隐藏表位等优点，在检测、诊断、治疗等领域应用广泛。因此，发展EGFP纳米抗体在基础研究中具有广泛应用。本专利技术公开了一种可以与EGFP标签特异性结合的单域重链抗体，可以与HRP酶偶联作为检测抗体并用于对EGFP标签融合蛋白的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够与EGFP标签特异性结合的纳米抗体，可以被用于检测抗体从而检测EGFP标签的工具。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种EGFP纳米抗体，具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQIDNO.2所示。以及提供了一种还有如SEQIDNO.2所示核酸序列的载体，和含有该载体的宿主细胞。本专利技术提供了EGFP纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)表达载体的构建：表达载体pET-25b用NotI、NocI进行双酶切，以F-long与R-long为引物进行PCR扩增获得PCR产物，使用割胶回收试剂盒对目的基因和载体进行回收；按照EasyGeno快速重组克隆试剂盒说明书构建表达载体，载体与各个片段的摩尔比例在1:2-1:3之间，并将连接产物钙转化至Rosseta感受态细胞中，37℃倒置培养过夜，菌落PCR验证插入片段；(2)EGFP纳米抗体表达：将pET-25b-EGFP表达菌接种于培养基中培养，当OD600＝0.5左右时，向培养物中加入IPTG诱导剂于20℃进行诱导培养；收集菌体，用PBS重悬沉淀，超声破碎后收集上清，用Ni柱纯化获得EGFP纳米抗体。本专利技术还提供了HRP酶偶联EGFP纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)HRP酶氧化：将HRP酶溶于HAc-NaAC溶液中，加入NaIO4溶液，4℃避光反应20min；加入乙二醇，4℃避光终止反应20min，离心取上清进行透析；(2)HRP酶标记：加入待标记抗体，4℃避光旋转混匀4h；加入CH3BHNa，室温反应2h；再加入乙醇胺封闭未结合位点，室温反应30min；(3)加入终饱和度45％的硫酸铵粉末，4℃静置2h；离心后弃上清用PBS重悬沉淀得到HRP酶标记抗体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用基因工程技术，将EGFP作为标签与其它蛋白融合，同时将筛选得到的EGFP纳米抗体与HRP酶偶联作为检测抗体对带有EGFP标签的蛋白进行检测，相比于传统的抗体，纳米抗体具有高亲和力、高特异性、高表达性等优点，可以和EGFP标签融合蛋白高效特异性结合，同时又避免了载体本身自带标签影响检测结果。附图说明图1为纳米抗体原核表达SDS-PAGE结果；图2为纳米抗体特异性验证；图3为融合蛋白SDS-PAGE结果。图4为HRP检测二抗检测EGFP标签蛋白(间接检测)具体实施方式本专利技术采用固体亲和筛选方法，从EGFP免疫性的纳米抗体基因库中筛选得到高效表达的纳米抗体，与HRP酶偶联检测EGFP标签融合表达蛋白。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1本专利技术筛选得到了一种抗EGFP纳米抗体基因序列，根据序列比对软件VectorNTI分析该克隆株的基因序列，最终得到氨基酸序列SEQIDNO.1所示的纳米抗体。(1)将EGFP抗原用1×CBS稀释，100ul/孔加入酶标板中，4℃过夜；(2)PBS洗涤3次，加入4％脱脂乳，300μL/孔，37℃恒温培养箱中封闭1h；(3)PBS洗涤3次，加入噬菌体文库，100μL/孔，于37℃恒温培养箱中孵育1h；(4)先用PBST洗涤5次，再用PBS洗5次，加入100μLpH4.0Gly-HCl洗脱液，37℃恒温培养箱中洗脱5min，丢弃洗脱液，再加入100μLpH2.2Gly-HCl洗脱液，37℃恒温培养箱中洗脱10min；(5)取洗脱液于1.5mL离心管中，加入15μLTris-HCl中和，混匀后取10μL洗脱物测洗脱量，其余进行扩增。DNA序列(SEQIDNO.2)CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCACCTGTGCAGCCTCTGGAAGCACCTTCAGTAGGTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGTGAGTTGGTCGCAACTATTAGTCGTCTTCTGACCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGAACATGAACCGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAAAGCCAGTGCGGTGGCGGACCTCGATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGACGGCCAGGCCGGCCAG编码具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列QVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGSTFSRYAMGWYRQAPGKQRELVATISRLLTTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLNMNRLKPEDTAVYYCKASAVADLDDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAGQ实施例2EGFP纳米抗体表达纯化(1)表达载体的构建：表达载体pET-25b用NotI、NocI进行双酶切，以F-long与R-long为引物进行PCR扩增获得PCR产物，PCR反应50uL体系为：ddH2O37.5uL，模板1uL，dNTP(2.5mM)4uL，5×PSBuffer5uL，F-long与R-long引物1uL；反应条件：94℃3min(98℃10s，55℃15s，72℃1min)25cycles，72℃5min，4℃，∞。，共经25个循环。使用割胶回收试剂盒对目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对EGFP标签的纳米抗体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对EGFP标签的纳米抗体，其特征在于，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


2.一种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述的氨基酸序列，其核酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种包含权利要求2所述的核酸序列的载体。


4.一种包含权利要求3所述的载体的宿主细胞。


5.权利要求1所述的纳米抗体在检测抗体的应用。


6.根据权利要求5所述检测抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：付金衡，刘贝，王丹，黄云祥，钟引凤，周方月，
申请(专利权)人：南昌大佳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36