一种丝素蛋白微载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高分子微载体及其制备方法，属于生物医学技术领域。本发明专利技术采用同轴高压静电技术和冷冻干燥法，将丝素溶液与药物溶液在高压电场的作用下分化成具有芯－壳结构的微米级液滴，经液氮凝固后，再经冷冻干燥制得难溶于水的微载体。该微载体为芯－壳结构的微球状，微球直径为１００～５００μｍ；其壳层成分为丝素蛋白，所述丝素蛋白分子，其中无归卷曲构象为８０％～９０％；壳层呈多孔结构，孔径为５～２０μｍ；其芯核成分为水溶性药物。这种丝素微载体在细胞培养、药物缓释等领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高分子微载体及其制备方法，特别涉及一种采用蚕丝丝素为主要 原料，并载有水溶性药物的丝素蛋白微载体及其制备方法，属生物医学材料

技术介绍
高分子微球具有其它材料所不具备的特殊功能，是当前的研究热点之一。微球用 途广泛，可用于药物载体、酶和细胞的固定化、生物活性物质的分离纯化和细胞培养载体等 方面，其中将微球作为细胞生长、增殖载体(微载体)的研究逐渐受到人们的关注。微载体是 指直径在60 250 μ m，用于贴壁依赖型细胞生长的微珠，其巨大的比表面积可增大细胞 培养面积，实现大规模的细胞培养。此外，利用微载体进行细胞培养，可用简单的显微镜观 察细胞在微球表面的生长情况，并简化了细胞生长各种环境因素的检测和检控，同时可高 效利用培养基，并兼有单层培养和悬浮培养的优势，是一种先进的细胞培养技术。早期微载体多采用合成聚合物制成，如聚羟乙基丙烯酸甲酯、葡聚糖、聚苯乙烯 等。合成聚合物制备的微载体重复性和力学性能较好，但缺乏细胞识别位点，影响细胞在其 表面的黏附、生长。因此，生物相容性好、价格低廉的天然高聚物逐渐成为微载体原料的首 选。目前，常用的有胶原、明胶、纤维素、甲壳质及其衍生物以及海藻酸盐等。蚕丝丝素蛋白 作为一种天然高聚物，具有优良的生物学性能及一定的生物可降解性，是较理想的制备微 载体的原料。生长因子是一种可刺激细胞生长和增殖的细胞外多肽信号分子。将生长因子装载 到生物材料上可明显促进细胞的生长和增殖，是生物医学领域的研究热点之一。然而生长 因子半衰期短，极易失活，因此如何在制备微球过程中保持药物活性仍然有待于进一步探 讨。载有生长因子的芯-壳结构丝素微载体具有其他材料所没有的优点，是一种具有发展 潜力的新型细胞微载体。在本专利技术作出之前，中国专利技术专利(CN 1556202A)公开了一种动物细胞培养用 微载体及其制备方法，该专利技术利用脱脂棉铜氨溶液制备微球，以硫酸为致孔剂，用2-二 乙氨基氯乙烷盐酸盐修饰微球表面。这种多孔微载体具有非常大的比表面积，为细胞 提供了生长空间。在中国专利技术专利(CN 1641017A) “一种用于大规模培养细胞的微载 体”中，采用明胶和壳聚糖溶液为原料制备实心与多孔微载体。该微载体可以支持细胞 生长并能长其月维持细胞功能。在“Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres" 文献中，报道了以碳酸氢铵为致 孔剂，采用双乳化法制备了 PLGA微载体，且OTH3T3细胞在其上黏附、分化效果良好。文献 "Employing human keratinocytes cultured on macroporous gelatin spheres to treat full thickness-wounds: an in vivo study on athymic rats" 中公开了一种制备直径为133 321 μ m明胶微载体的技术方案，其角化细胞能 在载体表面及孔内部较好的黏附与分化。大量研究表明，高分子微球在细胞培养领域具有 广阔的发展前景，各种新材料制备的微球层出不穷。4蚕丝蛋白是由蚕绢丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等二十多种氨基酸组成，具有良好的生物相容性和优良的理化性能且可被生物 降解。在非纺织领域，家蚕丝素纤维已长期用作外科手术缝合线。近年来，将丝素蛋白应用 于人工皮肤、人工血管、人工骨、药物缓释载体以及酶固定材料的大量研究结果表明，丝素 蛋白材料无毒性、无刺激作用，对细胞的黏附、生长、增殖以及分化的支持作用良好，其优良 的理化性质以及独特的生物相容性，是一种应用前景广阔的生物材料。然而，将蚕丝丝素蛋 白制备成为细胞微载体的技术至今未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种载药率高，比表面积大，生物相容性好，适合于细胞培养 的丝素蛋白微载体及其制备方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种丝素蛋白微载体，它为 芯-壳结构的微球状，微球直径为100 500 μ m;其壳层呈多孔结构，孔径为5 20 μ m, 壳层的成分为丝素蛋白，所述丝素蛋白的分子结构中，无归卷曲构象为80% 90%，其余为 Silk I和Silk II构象；其芯核的成分为水溶性药物。本专利技术还提供上述丝素蛋白微载体的制备方法将蚕丝脱胶、溶解、透析处理后得 到浓度为1% 10%/wt的丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工1、将吗啉-乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基_3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亚胺 溶解于丝素蛋白溶液中，得到壳层溶液；按质量比，丝素蛋白吗啉-乙磺酸N-羟基丁二 酰亚胺1-乙基_3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亚胺为1 :0. 05 0. 25 0. 05 0. 2 0. 1 0. 35。或者采用将京尼平溶解于丝素蛋白溶液中，按质量比，丝素蛋白京尼平为1 0. 1 0. 40，得到壳层溶液。2、将水溶性药物溶解后得到浓度为lOOng/ml lOOOng/ml的水溶性药物芯层溶液。3、采用高压静电方法，将丝素壳层溶液和水溶性药物芯层溶液经两个喷头喷出微 米级的液滴，以液氮为凝固浴，得到具有芯_壳结构的固化液滴；所述的两个喷头为同轴套 装在一起，其中外层的一个为壳层溶液喷头，内层的一个为芯层溶液喷头。4、采用冷冻干燥法将固化的液滴干燥，得到一种芯_壳结构微球状的丝素蛋白微 载体。本专利技术技术方案中所述的丝素蛋白为天然家蚕、柞蚕或天蚕丝素蛋白；所述的水 溶性药物为酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、转化 生长因子- β、转化生长因子- α、神经生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生因子等细 胞生长因子中的一种或它们的任意组合。本专利技术技术方案中采用的高压静电工艺条件为电源电压3 15 kV;芯核溶液的 推注速度为0. 1 1 ml/h，壳层溶液的推注速度为0. 1 5ml/h。本专利技术技术方案中，壳层溶液喷头的喷针内径为1 2mm;芯层溶液喷头的喷针外 径为0. 45 1. 6mm,内径为0. 1 1. 2_。本专利技术的原理是将直流高压电源施加于聚合物溶液或熔体与收集装置之间，使聚合物溶液或熔体带上几千伏至上万伏高压静电，带电液滴在电场力的作用下在注射器或 毛细管顶点被加速，当电场力足够大时，聚合物液滴可克服表面张力形成喷射细流。当聚合 物溶液浓度较低，粘度较小时，其在一定范围内的高压电场作用下会分化成连续的小液滴， 喷入凝固浴中即可得到粒径均勻的微球。本专利技术采用的装置具有两个注射器，内层针头套在外层针头内并保持同轴，两个 针头之间留有一定的空隙，保证外层丝素溶液能够顺利流出与芯成分的生长因子溶液汇 合。在高压电场的作用下，两液体在喷口处汇合时，由于时间极短，液滴固化前不会融合为 一体，从而形成具有芯-壳结构的丝素蛋白微球。同时由于生长因子溶液在电场作用下喷 出后全部包埋于微球内部，基本无损失，因此这种芯_壳结构的丝素微球具有较高的药物 包埋率。将EDC加入丝素溶液中后，其首先与蛋白质羧基侧链偶合形成一种中间产物酰基 异脲，然后受到蛋白质上伯胺基团的亲核试剂进攻而形成酰胺交联，从而使蛋白质水溶液 迅速形成凝胶。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王璐，李明忠，吕强，卢神州，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32