出芽短梗霉菌株和其制备方法及用于生产无色素茁霉多糖技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种以出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕｌａｎｓ）为原始菌株，通过紫外线（ＵＶ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）诱变和筛选获得的不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁霉多糖生产菌株——出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）Ｗ２４，该菌株于于２０１０年０６月２５日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：ＣＧＭＣＣ　ＮＯ．３９４５。同时还涉及该菌株的制备方法以及利用该菌株在生产无色素茁霉多糖方面的应用。当蔗糖浓度为１０％、酵母膏浓度为０．２％、玉米浆浓度为０．４％（质量比）时，制备得到的茁霉多糖产量最高，达到２６ｇ／Ｌ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种以出芽短梗霉 (Aureobasidiumpullulans)为原始菌株，通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变 和筛选获得的不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁霉多糖生产菌株——出芽短梗霉 (Aureobasidiumpullulans)菌株W24，同时还涉及该菌株的制备方法以及该菌株在生产无 色素茁霉多糖方面的应用。
技术介绍
茁霉多糖，又名普鲁兰或短梗霉多糖，是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) 以淀粉糖为原料发酵产生的细胞外纯天然高分子多糖。它的结构可以看作是麦芽三糖通过 α _1，6糖苷键聚合而成，所以，分子中既有α_1，4糖苷键，又有α_1，6糖苷键。易溶于水， 安全无毒、可食用、低热值；可塑性、成膜性好、簿膜隔气性佳；用于包装具有保色、保香、保 鲜、抗氧化等功效。茁霉多糖膜最特殊的性质是比其他高分子膜的透气性能低，氧、氮、二 氧化碳和香气等气体几乎不能通过，使用茁霉多糖薄膜，能有效阻止水分，氧、氮、二氧化碳 等气体在果蔬内外的交换，抑制果蔬的呼吸作用，有效地减少了果蔬营养物质的耗损。例 如，茁霉多糖丙酸醋溶液喷于冷冻干燥的青菜，不用防潮袋可保存5个月，颜色和形状变化 小，烹调后仍保持新鲜风味。对于油脂类含量高的果实，如花生、核桃、杏仁、豆类、干鱼、贝 类，干燥的薯条、萝卜类，在表面喷涂极薄的茁霉多糖膜能有效防止氧化作用。涂在鸡蛋上 还能提高鸡蛋强度，增加表面洁度。而茁霉多糖不易被体内消化酶消化，热量比一般糖类产 品低一半；在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染。在化妆品、药品、保健品行 业中可作为填充剂和粘结成型剂，在医药工业中还可作为血浆代用品；在石油工业中，可作 为三次采油的驱油剂；另外，在烟草制造工业、农业种子保护等领域也有广泛的应用。日本 Hayashibara公司生物化学研究所最近同美国辉瑞(Pfizer)公司合作成功开发出以茁霉 多糖为原料制成的硬质胶囊，这种硬质胶囊新产品的崩散性、不透氧性和稳定性都很好，目 前已推入世界市场，由辉瑞公司下属的Capsugel公司以NP capsTM的品名正式上市销售。 最近，美国辉瑞公司将茁霉多糖用于生产一种新型健齿口香糖如Listerine Pocketpaks, 已在欧美等地成为热销产品。因此，茁霉多糖是一种具有极大经济价值和开发潜力的多功 能新型生物材料，具有广阔的市场前景。面对国外茁霉多糖产业的快速发展，采用育种技术提高茁霉多糖菌种生产水平、 降低色素产量，建立先进的茁霉多糖发酵和提取工艺，降低生产成本，摆脱国外技术垄断， 是我们急待解决的问题。我国北方玉米种植广泛，采用现代高新技术开发玉米化工等系列 产品产业化高效生产技术是发展北方地区经济的可行之路。本项目采用紫外(UV)诱变和 亚硝基胍(NTG)诱变获得不产色素的高产茁霉多糖生产菌株；采用生物统计优化技术建立 以玉米为主要原料的出芽短梗霉发酵生产茁霉多糖生产工艺。降低茁霉多糖生产成本，实 现茁霉多糖的国产化生产，争取以此带动国内的多糖生产企业并赶超国外同行业水平。同 时提升我国农业高技术的自主创新能力与国际竞争力都具有重要意义。本专利成果可以充分利用丰富的玉米资源，促进可再生资源产业的高效、优质、快速发展，能够满足玉米深加 工生产企业需求，创造良好的经济效益和社会效益，具有较好的产业化优势和广阔的市场 发展前景。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)为原始菌株， 通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变和筛选，获得不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁 霉多糖生产菌株，获得的菌株其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已 于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO. 3945。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24是一种多形态真菌，有酵母样和真菌 菌丝体两种形态，这两种形态的形成受培养基成分、培养条件等各种因素的影响，它们可以 相互转变。在查氏琼脂培养基上生长良好，形成疏松边缘不整齐的真菌性菌落，菌落粘稠， 白色，最终成为黄色或黑色，有皱褶并发亮，皮革状。色泽变化由中央向边缘扩展，边缘有时 可带白色环。新生菌丝壁较簿，细而无色透明，横隔少，老龄菌丝壁厚，色由暗转变黑。菌丝 弯曲有隔，可以横裂形成芽管再发芽。分生孢子产生于菌丝的乳头状突起上，椭圆形。出芽 短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24在含糖培养基中生长良好，培养基pH5. 5 7. 5之 间，培养温度26°C 32°C，发酵过程中以酵母样细胞为主，所得产品茁霉多糖不引起任何 生物学毒性和异常状态，广泛用于食品、化妆、医药等工业。最近，茁霉多糖被我国卫生部正 式批准允许在部分食品中使用。本专利技术的目的之二是提供一种上述不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁霉多糖生产 菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24的制备方法；该制备方法通过紫外 线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变和筛选，易于实施、简洁、高效。本专利技术的目的之三是提供一种利用本专利技术获得的菌株——出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans) W24,以玉米浆为氮源发酵生产无色素茁霉多糖的方法。原始菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)购自中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，菌株的编号是CGMCC N0. 3. 837。最佳培养温度为28°C，发酵 生产茁霉多糖过程中PH —般控制在6. 0左右，发酵过程中出芽短梗霉会分泌出与黑色素 (melanin)类似的黑色或墨绿色物质，这种物质牢固地粘附在茁霉多糖上，很难除去，增多 了下游处理操作，增加了生产成本。所以，选育低色素高产量的菌株是从根本上解以上问题 的方法。本专利技术的步骤为第一步至第三步所用培养基为液体培养基(质量比)蔗糖5%、酵母膏 0.2%、(NH4) SO4 0.04%, K2HPO4O. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 01%, NaCl 0. 2%，其余为水；pH = 5. 5 7. 5、115°C、30min 灭菌第一步，原始菌株的培养及孢子悬浮液的制备挑取一环原始菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于装液体培 养基的试管中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养48 56h ；再按2% 20%体积比的接种量接种于装有液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下 摇床培养72 96h ；然后向三角瓶中加入灭菌的玻璃珠，充分振荡，使孢子脱落，用四层纱 布过滤，再将所得全部孢子转移到装有新鲜液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养8 12h，使孢子活化萌发，用血球计数板计数孢子数，调整(浓度 过大时，添加无菌水稀释，浓度过小时先通过离心收集菌体再用无菌水稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ），其于２０１０年０６月２５日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：ＣＧＭＣＣ　ＮＯ．３９４５。

【技术特征摘要】
一种出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，其于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3945。2.权利要求1所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备方法，其步骤如下A、原始菌株的培养及孢子悬浮液的制备挑取一环原始菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于装有液体培 养基的试管中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养48 56h ；再按2% 20% 体积比的接种量接种于装有液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下 摇床培养72 96h ；然后向三角瓶中加入灭菌的玻璃珠，充分振荡，使孢子脱落，用四层纱 布过滤，再将所得全部孢子转移到装有新鲜液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养8 12h，使孢子活化萌发，用血球计数板计数孢子数，调整孢子浓 度，得到孢子浓度为107ml数量级的孢子悬浮液；液体培养基的质量配比为蔗糖5%、酵 母膏 0.2%、(NH4) SO4 0. 04%, K2HPO4 0. 2%、MgSO4 · 7H20 0. 01%, NaCl 0.2%，其余为水; 培养基的pH为5. 5 7. 5、115°C条件下进行30min灭菌。B、菌种诱变原始菌株经上一步处理后，分别采用紫外线或亚硝基胍两种不同的诱变方法进行菌种 诱变；C、菌株的筛选选择菌落直径大、颜色浅的经菌种诱变后的菌落，在培养皿平板上对菌落做标记，挑取 一环每个做标记的菌落分别接种于装有液体培养基的试管中，25 32°C、150 200rpm摇 床培养48 56h，之后按2% 20%体积比的接种量接种在装有液体培养基的三角瓶中， 25 V 32°C、150 200rpm摇床培养96 108h，测茁霉多糖产量、测发酵液OD值、生物 量，比较发酵液颜色，观察粗多糖颜色，选择颜色浅和产量高的相应标记菌落做为下一次 诱变的出发菌株；然后经过与上述步骤相同的24轮诱变获得目的菌株，即为出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)。3.如权利要求2所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备方法，其特征 在于紫外线诱变首先是预热紫外灯和磁力搅拌器各30min，然后取5ml、孢子浓度为IO7/ ml数量级的孢子悬浮液放置于直径6cm的培养皿中，再放入灭菌的磁力搅拌珠，使培养皿 距离紫外灯15cm，打开磁力搅拌器，使菌液均勻接受紫外线照射，分为三个诱变组，各照射 3min,5min和lOmin，之后将菌液在红光下用无菌水做梯度稀释，每个诱变组取稀释梯度为 10_5、10_6、ΙΟ7的菌液，然后涂布培养皿平板，每组每个梯度各涂布10个培养皿平板；所有 培养皿平板25 32°C避光培养3天，得诱变菌种。4.如权利要求2所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备方法，其特征 在于亚硝基胍诱变是取1. 8ml孢子浓度为107ml数量级的孢子悬浮液，加入0. 2m...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡耀辉，王玉华，苏安祥，刘杰，冯印，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]