本发明专利技术公开了一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法：取正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水混合充分后静置分层，取上相为流动相，下相为固定相，取柳叶腊梅的初提物溶于下相中作为供试品，将固定相充满多层线圈分离柱，在５００～１０００ｒ／ｍｉｎ转速下，以０．１～３ｍｌ／ｍｉｎ的流速注入流动相，以波长６０～４００ｎｍ的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取供试品进样，同时用自动部分收集器收集流出液，ＨＰＬＣ检测，将与６，７－二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且纯度大于９８％的洗脱液合并，旋转蒸发仪回收溶剂，得到６，７－二甲氧基香豆素。本发明专利技术方法分离效果好，污染小，提取率高，产品纯度高，时间短，操作方便，条件固定，易于重复，从而可以进行工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药及生物领域，关于柳叶腊梅的有效成分的提取方法，具体涉及 一种利用高速逆流色谱从柳叶腊梅中提取并分离香豆素类化合物的方法。
技术介绍
畲药是我国民族特色药物之一，在畲族中有着悠久的应用历史。浙南地区畲 族百姓主要用于治疗伤食所致的痞满证和慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡引起的胃胀、胃 痛、泛酸等。柳叶腊梅鲜叶可按茶叶炒青工艺制成茶冲泡饮用，也可炼制挥发油制成片 剂、滴丸，用于镇咳、平喘、防治感冒和流行性感冒。柳叶腊梅具有抗菌、消炎、抗病 毒，增强肌体免疫力等功能，无毒副作用，其市场及经济效益前景非常看好。香豆素类化合物在医药方面的应用是广泛认可的，特别是6，7-二甲氧基香豆 素(如式1所示)，又称滨蒿内酯、二甲氧香豆素、七叶内酯二甲醚、蒿属香豆精和东喘 宁，具有显著的降压作用及利胆、抗炎、镇痛、降血脂、平喘、抗凝等作用。临床上主 要用于治疗心绞痛、心律失常、支气管哮喘等疾病。och31 2然而目前国内外对柳叶腊梅的化学成分研究甚少，更未见关于上述化合物的同 时分离的报道。一般柱分离等传统的分离方法不仅耗时，费力，而且高污染，高成本， 尚风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前柳叶腊梅的有效成分的提取还未见报道，并且在避 免传统工艺的缺点基础上而建立起来的一种香豆素类化合物的分离方法。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是，所述的方法为取柳叶腊 梅的初提物为原料，以高速逆流色谱法分离提取，取体积比为0.1 2 1.2 0.5 1.5 1.2的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按 上下两相分开，取上相为流动相，下相为固定相，超声脱气，取柳叶腊梅的初提物，溶 于下相中作为供试品，所述柳叶腊梅的初提物与下相的质量体积比为lg 20 80ml; 将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500 lOOOr/ min转速下，以0.1 3ml/min的流速注入流动相，以波长60 400nm的紫外检测器检 测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动部分收集器收集流出液，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7-二甲氧基 香豆素标准品保留时间相同且6，7-二甲氧基香豆素纯度大于98%的洗脱液合并，用旋 转蒸发仪回收溶剂，得到6，7-二甲氧基香豆素。所述收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7，8-三甲氧基香豆 素标准品保留时间相同且6，7，8-三甲氧基香豆素纯度大于98%的洗脱液合并，用旋转 蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8-三甲氧基香豆素。所述的柳叶腊梅的初提物为弱极性溶剂的超声提取物的干燥物，所述所极性 溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合，所述的样品溶液中 含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0.1 0.5 350g/ml。更具体的，所述的方法包括如下步骤(1)过20目筛的柳叶腊梅枝干粉末加入弱极性溶剂中，在频率20 300kHz超 声作用下提取0.5 2小时，然后过滤，取滤液浓缩至质量无变化，干燥得到柳叶腊梅初 提物，所述弱极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合；所 述弱极性溶剂的用量以柳叶腊梅枝干粉末的质量计为20 80mL/g ；(2)取体积比为0.1 2 1.2 0.5 1.5 1.2的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、 水组成高速逆流溶剂体系，混合后静置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相为固 定相，超声脱气后，将步骤(1)得到柳叶腊梅初提物溶于下相作为供试品，所述柳叶腊 梅的初提物与下相的质量体积比为lg 20 80ml ；(3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在 500 1000r/min转速下，以0.1 3ml/min(优选0.8 3ml/min)的流速注入流动相， 当明显有流动相流出时，取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动部分收集器收集 流出液，所述样品溶液中含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分 离柱的体积比为0.1 0.5 350g/mL,用波长60 400nm(优选210 320nm)的紫外 检测器检测，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7-二甲氧基香豆 素标准品保留时间相同且6，7-二甲氧基香豆素纯度大于98%的洗脱液合并，用旋转蒸 发仪回收溶剂，得到6，7-二甲氧基香豆素；将与6，7，8-三甲氧基香豆素标准品保留 时间相同且6，7，8-三甲氧基香豆素纯度大于98%的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶 剂，得到6，7，8-三甲氧基香豆素。所述步骤(2)中供试品中柳叶腊梅初提物的浓度优选为0.017 0.025g/mL。所述步骤(1)中的弱极性溶剂优选为体积百分含量40 60%的甲醇水溶液或体 积百分含量40 60%的乙醇水溶液。所述步骤(3)中高效液相色谱的条件为色谱柱为Agilent EclipseXDB_C18 (5umX 4.6 X 150mm)。流动相甲醇水(45 55，v/v),等度洗脱。 流速lml/min。柱温30°C。检测波长326nm。进样量10iU。专利技术人首次从柳叶腊梅中分离得到天然化合物6，7-二甲氧基香豆素(式1所 示)和6，7，8-三甲氧基香豆素(式2所示)，填补了目前柳叶腊梅中主要香豆素类化 合物提取分离的空白。本专利技术利用的高速逆流色谱采用非固定相载体的液液分配色谱 技术，相对于传统的分离方法具有分离效果好，污染小，提取率高，产品纯度高，时间短，操作方便等优点。本专利技术条件固定，易于重复，从而可以进行工业化生产。对柳叶 腊梅的开发和利用具有重要的应用价值，可以有效的促进畲药资源保护和可持续发展再 利用。附图说明图1: 6，7-二甲氧基香豆素的高效液相色谱检测谱图。图2: 6，7，8-三甲氧基香豆素的高效液相色谱检测谱图。具体实施例方式下面以具体实施例对本专利技术方案做进一步说明，但本专利技术的保护范围不限于 此。实施例1取足量的干燥的柳叶腊梅枝干粉碎物过20目筛。准确称量粉碎物lg，加入20ml 体积百分浓度为40%的甲醇水溶液进行超声提取，超声时间为lh，频率为20KHz。所得 溶液过滤，取滤液浓缩至质量无变化，室温通风放置干燥得柳叶腊梅的初提物备用。高速逆流色谱的分离提取，在分液漏斗中加入正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水 (体积比为0.1 1.2 1.5 1.2)，混合充分后静置4小时，按上下两相分开，上相为流 动相，下相为固定相，20KHz超声脱气20min。称取柳叶腊梅的初提物O.lg，溶于8ml 下相中，得到供试品，作为样品溶液。将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为350ml， 设定高速逆流色谱仪，当仪器以500r/min稳定旋转并且两相达到平衡时，以3ml/min泵 入流动相，当明显有流动相流出时，注入样品溶液，同时开始用自动部分收集器收集流 出液，收集速度为3min/tUbe，紫外检测器的检测波长为210nm，将收集得到的流出液用 高效液相色谱进行检测，将与6，7-二甲氧基香豆素标准品保留时间(3.77min)相同且 6，7-二甲氧基香豆素纯度大于98%的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法，其特征在于所述的方法为：取柳叶腊梅的初提物为原料，以高速逆流色谱法分离提取，取体积比为０．１～２：１．２：０．５～１．５：１．２的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相为固定相，超声脱气，取柳叶腊梅的初提物，溶于下相中作为供试品，所述柳叶腊梅的初提物与下相的质量体积比为１ｇ∶２０～８０ ｍｌ；将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在５００～１０００ｒ／ｍｉｎ转速下，以０．１～３ｍｌ／ｍｉｎ的流速注入流动相，以波长６０～４００ｎｍ的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动部分收集器收集流出液，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与６，７－二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且６，７－二甲氧基香豆素纯度大于９８％的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到６，７－二甲氧基香豆素；所述的柳叶腊梅的初提物为弱极性溶剂的超声提取物的干燥物，所述所极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合，所述的样品溶液中含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为０．１～０．５：３５０ｇ／ｍｌ。...
【技术特征摘要】
1.一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法，其特征在于所述的方法为 取柳叶腊梅的初提物为原料，以高速逆流色谱法分离提取，取体积比为0.1 2: 1.2 0.5 1.5: 1.2的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合充分后静 置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相为固定相，超声脱气，取柳叶腊梅的初提 物，溶于下相中作为供试品，所述柳叶腊梅的初提物与下相的质量体积比为lg:20 80 ml；将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500 1000r/min转速下，以0.1 3ml/min的流速注入流动相，以波长60 400nm的紫外检测 器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动部 分收集器收集流出液，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7-二甲 氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7- 二甲氧基香豆素纯度大于98%的洗脱液合并， 用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7-二甲氧基香豆素；所述的柳叶腊梅的初提物为弱极性溶剂的超声提取物的干燥物，所述所极性溶剂为 水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合，所述的样品溶液中含有的柳 叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0.1 0.5 350g/ ml ο2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述收集得到的流出液用高效液相色谱进行 检测，将与6，7，8-三甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7，8-三甲氧基香豆素纯 度大于98%的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8-三甲氧基香豆素。3.如权利要求1或2所述的高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法，其特征在于所 述的方法包括如下步骤(1)过20目筛的柳叶腊梅枝干粉末加入弱极性溶剂中，在频率20 300kHz超声作 用下提取0.5 2小时，然后过滤，取滤液浓缩至质量无变化，干燥得到柳叶腊梅初提物， 所述弱极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿，杨春，应国清，易喻，梅建凤，程文亮，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86
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