一种融合小泡，所述融合小泡由病毒体和脂质体脂质构成，并包裹有至少一种治疗性或免疫活性物质，所述融合小泡包含具有不同融合特征的融合蛋白或所述融合蛋白的片段，所述片段具有完整融合蛋白的融合活性和特征，其程度至少能与靶细胞的生物膜相融合。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,其制备方法和含有该小泡的药物组合物的制作方法
本专利技术涉及用于向细胞和组织输送所选物质，如核酸、蛋白质、肽、抗原、药物和美容剂的作为高效和通用性包裹系统的新型融合小泡。医学治疗的首要目的之一是向患病部位有效输送治疗物质。虽然某些治疗物质可以游离形式输送，但其它物质由于它们可能被从导入部位快速清除或不能通过生物屏障，或由于它们的全身毒性，需要运载体或载体以到达和进入它们的目的地。向细胞和组织输送物质需要的载体应是有效的、柔韧的、易于制备和安全的。目前向真核细胞输送物质的现有方法包括采用病毒或非病毒载体。病毒载体是复制缺陷性病毒，其部分编码序列被治疗基因的序列置换，虽然重组病毒是高效的基因输送和表达载体，但它们目前限于输送核酸且它们在人类医学上应用的安全性问题尚未确定。大多数非病毒输送系统运作水平如下就基因输送而言，输送载体负载的感兴趣物质(如蛋白质、核酸、药物或其它治疗药物)经胞吞作用靶向细胞核并进入。非病毒系统如脂质体的主要缺点是它们向细胞输送物质的效率低(Chu等编；Legendre和Szoka，1992，Pharmaceut.Res.第9卷，1235页)，推测是由于脂质体表面缺少融合介导分子。一种杂交类型的输送系统病毒体(virosome)，将病毒的有效输送机制与非病毒输送系统的通用性和安全性联合起来。病毒体重建了无传染性核衣壳的包膜和可从各种病毒衍生的遗传物质。这些病毒体的功能在于，它们的膜融合活性密切模拟了完整病毒已明确的只通过病毒融合蛋白质所介导的低pH依赖性膜融合活性。象病毒那样，病毒体可被受体介导的胞吞作用迅速内化。与病毒系统相反，病毒体安全，因为病毒的传染性核衣壳已被去除。因此病毒草体提供了可输送广泛的各种不同物质的有良好前景的运载系统，这类物质或包裹在其内部水相中或共同重建在其膜中。在病毒体膜中共同重建不同的受体还使得病毒体可靶向不同的细胞和组织。迄今病毒体通过在其表面加入抗原主要用作疫苗。目前用于制备病毒体的方案主要限制在于其不能产生高的包裹效率。对于产生平均直径约200nm的病毒体，其脂质浓度(约1mM)不到该病毒体所包裹水相的1％(Schoen等，J.Liposome Res.3767-792，1993)。这种低包裹率降低了病毒体介导的向细胞输送药物或基因的效率。因此，开发新的/新颖的能保留病毒体优良融合性能的更有效负载载体，及制备、负载和输送它们的方法是治疗性药物、蛋白质和基因输送领域的非常需要的目标。当前病毒体技术的问题之一是缺少有效包裹溶质，如蛋白质、核酸或药物的方法。本专利技术提供了解决病毒体包裹效率低问题的一种新颖方法。因此，本专利技术提供由病毒体和脂质体脂质组成的融合小泡，其能包裹至少一种治疗性或免疫活性物质，所述融合小泡可包含融合蛋白，优选至少两种不同的融合蛋白或其片段，所述片段具有该完整融合蛋白的能与靶细胞生物膜融合的融合活性和特征，及不同的融合特征。优选该小泡是单室性的。该小泡的直径通常在100-600nm范围内，优选直径在100-300nm之间，或直径在200-400nm之间，这取决于具体的小泡。本专利技术的优点是以极高脂浓度制备的脂质体具有高包裹效率。因此本专利技术提供了将脂质体的高负载容量与病毒体的有效细胞融合和输送能力相组合的方法，导致大大提高了对溶质如蛋白质、核酸和药物在可控大小的功能性嵌合病毒体内的包裹，从而能有效地向细胞输送治疗性或免疫活性物质。因此在本专利技术的一个优选的实施方案中，将感兴趣的物质首先加载或包裹在脂质体中。本专利技术所用脂质体的脂质宜选自阳离子脂质、合成的脂质、糖脂、磷脂、胆固醇及它们的衍生物。磷脂宜包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰肌醇及各种脂肪酰基组合物。阳离子脂质宜选自DOTMA(N--N，N，N-氯化三甲基铵)、DOTMA(N--N，N，N-氯化三甲基铵)、DOTAP(N--N，N，N-氯化三甲基铵)、DODAC(N，N-二油酰基-N，N，-氯化二甲基铵)、DDAB(溴化二十二酰基二甲基铵)和硬脂酰胺或其它脂肪簇胺等。它们通常与DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)混合配制成小的单室脂质体，DOPE广泛用作“辅助”脂质来促进其在核内体膜上的分布。脂质体的最优选脂质包括POPC/DDAB。在第二步骤中，含感兴趣物质的脂质体将与膜上具有不同类型融合蛋白的嵌合性病毒体融合。术语“融合蛋白及其片段”指能诱导和/或促进融合小泡膜与靶细胞的生物膜之间发生融合反应的蛋白质或其片段。调整大小后，脂质体-病毒体融合产物成为病毒体样颗粒，或脂蛋白体，其内腔中含有该感兴趣物质，仍能在不同条件下与生物膜进行第二次融合步骤，以输送治疗性或免疫活性物质。本专利技术的融合小泡可包裹至少一种物质，优选治疗性或免疫活性物质，它们宜选自DNA、RNA、siRNA、蛋白质、肽、氨基酸和药物活性物质或它们的衍生物。至少一种物质是美容剂、药物、抗原或其混合物。美容化妆物质的例子选自皮肤病学所用的治牛皮癣药物和抗真菌药。治疗性物质和药物的例子选自麻醉剂、血管生成抑制剂、抗痤疮制品、抗变态反应药、抗生素和局部用的化疗药、抗组氨药、抗炎症/抗感染药、抗癌制剂、抗原、抗原生动物药、抗风湿药、抗病毒疫苗、抗病毒药、凋亡药、细菌疫苗、化疗药、细胞静止药、免疫抑制剂、轻泻药、精神抑制剂。美容剂的优选例子是焦油制霉菌素和具有免疫学活性物质的药物阿霉素、长春碱、顺铂、甲氨喋呤、环孢素、布洛芬、HCV的T-细胞抗原和肿瘤相关抗原。将至少一种治疗性物质，如蛋白质、肽、核酸、药物、化疗或美容剂包裹入脂质体可采用本领域已知的任何方法，包括Monnard等，Biochim Biophys Acta.132939-50，1997；Wanerg等，J Lipsome Res.12(3)271-283，2002或Oberholzer等，Biochim Biophys Acta.141657-68，1999中所述的方法，及诸多其它熟知的方法。在本专利技术一优选实施方案中，通过用于制备纯脂质小泡的冻/融技术实现了脂质体高效包裹。用此法可将3kb以上的线性化质粒最初量的大约50％包裹在宜由1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)/溴化二十二酰基二甲基铵(DDAB)组成的大单室小泡(LUV)中(Monnard等，Biochim Biophys Acta.132939-50，1997)。在一优选实施方案中，本专利技术提供含显示不同融合特征的病毒性融合分子二元混合物的病毒体制品。在本专利技术另一优选实施方案中，采用不同的病毒血凝素(HA)融合蛋白质来构建嵌合性病毒体。如前所示(Tsurudome等，J Biol Chem.26720225-20232，1992)不同病毒毒株的HA融合蛋白质可显示融合和灭活的显著不同温度特征。例如，大约在pH5.0，X-31 HA在低温可有效引起融合，而在相同pH时，PR8/34或A/Singapore病毒的HA要求提高温度(＞25℃)。因此，在本专利技术一优选实施方案中，在其膜上含有蛋白质的嵌合性病毒体在两种不同温度下介导融合。不同的温度敏感性是这些融合蛋白的特别有利特征，因为它得以方便简单地控制融合反应。作为一个例子，本专利技术证明含本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：J·布鲁纳，S·瓦德鲁西，R·泽布里根，
申请(专利权)人：派维翁生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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