α－葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物制造技术

本发明专利技术描述了来自Ｈｙｐｏｃｅａ　ｔａｗａ、里氏木霉和Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ的分离的α－葡聚糖酶，以及含有它们的口腔护理组合物。该口腔护理组合物可用于预防或减少菌斑。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物优先权本申请要求2008年4月11日提交的美国临时专利申请序列号No. 61/044，316的 优先权，其以其整体引入作为参考。
技术介绍
齿斑的形成导致龋齿、牙龈炎症、牙周病以及最终导致牙齿损失。齿斑是细菌、上 皮细胞、白细胞、巨噬细胞及其他口腔分泌液的混合物。细菌产生高度分枝的多糖(highly branched polysaccharides)，其与来自口腔的微生物一起形成齿斑继续增殖的粘性基质。随着齿斑继续积累，出现石头一样硬的白色或浅黄色沉积物。这些沉积物称为钙 斑、牙石或牙垢，其在唾液中由菌斑(plaque)和矿物例如钙形成。对预防和/或减少齿斑以及相关牙齿损坏的新方法有着持续的需要。
技术实现思路
一方面，提供了分离的α -葡聚糖酶，包含下述氨基酸序列，即(a)与天然Hypocea tawa的α -葡聚糖酶(SEQ ID NO 1的38-635位氨基酸残基)有至少99%同一性；或者 (b)与 Trichoderma konilangbra 的 α-葡聚糖酶(SEQ ID NO :3 的 38-627 位氨基酸残基) 有至少85%同一性。另一个方面中，提供了编码本专利技术α-葡聚糖酶的分离多核苷酸以及含有该分离 多核苷酸的重组核酸。还提供了含有该重组核酸的载体和宿主细胞。在另一个方面中，提供了细胞培养物。在一些实施方式中，该细胞培养物含有生长 培养基和上述宿主细胞的群体。细胞培养物可用于提供在适于分离的α-葡聚糖酶产生的 条件下维持细胞培养物以产生本专利技术的α-葡聚糖酶。如果α-葡聚糖酶是分泌的，这可 从生长培养基中收获。在另一个方面中，提供了产生蛋白质的方法，其包括在适于分离的α-葡聚糖酶 产生的条件下维持如上细胞的培养物。在一些实施方式中，该方法还包括从生长培养基中 收获α-葡聚糖酶。另一个方面中，提供了方法，其包括接受选自以下的分离的α-葡聚糖酶(a) 具有与成熟Hypocea tawa的α -葡聚糖酶(SEQ ID NO 1的38-635位氨基酸残基)有 至少99%同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；(b)具有与成熟里氏木霉(Trichoderma reesei)的α -葡聚糖酶(SEQ ID NO :2的38-622位氨基酸残基)有至少85%同一性的氨 基酸序列的α-葡聚糖酶；或者(c)具有与成熟Trichoderma konilangbra的α -葡聚糖 酶(SEQ ID NO 3的38-627位氨基酸残基)有至少85%同一性的氨基酸序列的α -葡聚 糖酶；以及将该分离的α “葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合，以制备口腔护理组合物。 在一些实施方式中，α-葡聚糖酶不同于里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO :2的38-622 位氨基酸残基)。在一些实施方式中，该方法还包括包装该口腔护理组合物。在另一个方面中，提供口腔护理组合物，其包含(a) 口腔可接受的赋形剂；和(b)分离的α-葡聚糖酶。在一个相关方面中，提供了口腔护理组合物，其包含口腔可接受赋形剂和选自下 列的分离的α _葡聚糖酶(a)具有与成熟Hypocea tawa的α -葡聚糖酶(SEQ ID NO 1的 38-635位氨基酸残基)有至少99%同一性的氨基酸序列的α -葡聚糖酶；(b)具有与成熟 里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQID NO :2的38-622位氨基酸残基)有至少85%同一性的氨 基酸序列的α-葡聚糖酶；或者(c)具有与成熟Trichoderma koni Iangbra的α -葡聚糖 酶(SEQ ID NO 3的38-627位氨基酸残基)有至少85%同一性的氨基酸序列的α -葡聚 糖酶。在一些实施方式中，该α-葡聚糖酶不同于里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO 2 的38-622位氨基酸残基)。在一些实施方式中，α-葡聚糖酶以组合物重量的0.0001%至5%的浓度存在于 该组合物中。在一些实施方式中，该口腔护理组合物还包含第二种酶。在特定实施方案中，该第 二种酶是脱氨酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脲酶或纤维素酶。在一些实施方式中，该组合物配制成牙膏，尽管预见了其他的口腔护理制剂。在一 些实施方式中，该组合物例如包含增稠剂、表面活性剂、湿润剂和研磨剂中的至少一种。在另一个方面中，提供了方法，其中接受分离的α-葡聚糖酶，然后提供与口腔可 接受的赋形剂混合以制备口腔护理组合物。该口腔护理组合物可以包装。在另一个方面中，提供了包括在适于α -葡聚糖酶活性的条件下将本专利技术口腔护 理组合物与牙齿相接触的方法。该接触可以使用例如牙刷进行。在特定情况下，该方法导 致对齿斑的预防和/或减少。附图说明图 1 显示来自 Hypocea tawa (SEQ ID N0:1)、里氏木霉(SEQ IDNO 2)； Trichoderma konilangbra (SEQ ID NO 3)和哈茨木霉(Τ· harzianum) (SEQ ID NO 4)的 α-葡聚糖酶的氨基酸序列比对，以及基于比对的共有序列(SEQ ID NO :5)。显示α -葡聚 糖酶的多个特征，例如信号序列、催化结构域、接头结构域以及葡聚糖结合结构域。图2汇总与多种无细胞培养溶液过夜孵育后获得的不溶葡聚糖水解物的HPLC分 析结果的表格。图3显示在ρΗ4· 5和pH6. O的来自表达里氏木霉(Τ· reesei)、H. tawa和 Τ. koni langbra的推定α -1,3-葡聚糖酶的里氏木霉培养物的上清的活性。天然α -葡聚 糖酶在宿主菌株中未检测到。葡聚糖水解反应物根据培养体积而不是蛋白质含量上样。定义除非本文中另有说明，否则所有技术和科学术语应为本领域中常规的含义。为清 楚起见定义以下术语。其他定义可出现在本说明书的其他地方。本文所用的术语“α-葡聚糖酶”指水解多糖中1，3-α-D-糖苷键的酶。本文所 述的α-葡聚糖酶具有根据IUBMB酶命名法的EC 3. 2. 1. 59的活性，可水解不溶的葡聚糖。 α -葡聚糖酶的系统命名为1，3 (1，3 ； 1，4) - α -D-葡聚糖3_葡聚糖水解酶。在某些出版物 中，此酶可能称为1，3- α -葡聚糖酶。注意，本专利技术的酶可具有除1，3- α -D-糖苷活性之外 的其他活性，包括但不限于1，2- α -D-糖苷活性。本文所用的术语“口腔护理组合物”指成分混合物，在常规使用过程中其不是供有 意吞咽从而全身性施用特定治疗剂，而是保留在口腔中足够的时间以接触牙齿表面和/或 口腔组织，用以递送对口腔活性有益的试剂。口腔组合物可以是牙膏、洁齿剂、牙粉、牙凝 胶、龈下凝胶、漱口水、假牙产品、口喷雾、锭剂、口腔片剂、口香糖等等的形式。口腔组合物 还可以合并在条或膜上，用以直接施用或粘贴在口腔表面。除非另作说明，术语“洁齿剂”指膏剂、凝胶、固体或液体的口腔护理组合物制剂。 洁齿剂的实例有牙膏、牙齿凝胶和牙粉。洁齿剂可以是单相组合物或者可以是两种或更多 种分开的组合物的组合。洁齿剂可以是任何期望的形式，例如深条纹、表面条纹、多层、具有 包围膏剂的凝胶或者其任何组合。包含两种或更多种分开的组合物的洁齿剂中的每种组合 物可以包含于分配器中物理上分开的区室中本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的α－葡聚糖酶，其包含下列氨基酸序列：　　（ａ）与成熟Ｈｙｐｏｃｅａ　ｔａｗａ的α－葡聚糖酶（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的３８－６３５位氨基酸残基）有至少９９％同一性；或者　　（ｂ）与成熟Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ的α－葡聚糖酶（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３的３８－６２７位氨基酸残基）有至少８５％同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S金，S兰茨，M佩普森，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]