改良的诺如病毒ＲＮＡ检测方法技术

一种ＲＮＡ扩增工序，其包括以下工序：使用下述引物对中的至少两组，通过逆转录酶，生成包含启动子序列的双链ＤＮＡ，所述引物对为：由对于与诺如病毒的各个基因型的ＲＮＡ相同或者互补的核酸序列杂交效率高的第一引物和第二引物（该引物中的任意一者的５’末端附加有启动子序列）组成的引物对；以该双链ＤＮＡ作为模板，通过ＲＮＡ聚合酶生成ＲＮＡ转录产物；该ＲＮＡ转录产物继续作为利用所述逆转录酶合成ＤＮＡ的模板，生成所述双链ＤＮＡ。在所述ＲＮＡ扩增工序中，通过用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针测定被扩增的ＲＮＡ转录产物量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种简l更、迅速地测定i若如病毒(Norovirus) 的方法。本专利技术在临床检查、公共卫生、食品4全查、食物中毒 检查的领域中有用。
技术介绍
诺如病毒是属于人杯状病毒(human calicivirus )科的病毒, 其基因组中具有约7000个碱基的单链RNA。诺如病毒也称为小 圆结构病毒(Small Round Structured Virus, SRSV )。在日本报告的食物中毒中约20%被推测为起因于病毒。从 这些病毒性食物中毒例子的约80%以上中检测到诺如病毒。主 要的感染源是食品，生牡蛎经常成为问题。此外，从婴幼儿的 (散发的)急性胃肠炎中也检测到诺如病毒，还报告有从人到 人的感染例。由以上可知，诺如病毒的检查在乂>共卫生上及食 品的品质管理上成为很大的课题，期望开发使用基因扩增法的、 高灵敏度且迅速并且能够检测所有基因型或者检测率高的检查 方法。以前，诺如病毒的检测基本通过电子显樣支4竟进行观察。 该方法中，虽然能够检测所有基因型，但由于灵敏度低，检测 时需要l(^个/mL以上的病毒量，因此待测物仅限于患者粪便。 此外，即便能够观察病毒，也无法进行鉴定。此外，还开发了使用人杯状病毒的病毒样空心颗粒的特异 抗体冲企测ELISA的"i式剂(WO2000/079280号7厶才艮)。4旦是，冲企测 灵敏度与电子显微镜程度相同，决不能说是高灵敏度。作为以高灵敏度测定诺如病毒的手段，可以列举出将诺如 病毒RNA通过RT-PCR进行扩增的方法(日本专利3752102号公报)，但该方法的情况下，通常需要逆转录(RT)工序和PCR 工序这两个阶段的工序。这种情况不仅使操作变得繁杂，并成 为重现性变差的主要原因，而且还会增加二次污染的危险性。 此外，将所述RT工序和PCR工序合在一起的话，通常需要2小 时以上的时间，对于多个4寺测物的处理和冲企查成本的降4氐来i兌 是不合适的。作为靶RNA的定量法，正在广泛4吏用实时RT-PCR法，即， 在嵌入剂性荧光染料存在下实施紧接着RT工序之后实施的 PCR工序来观'J定荧光i曾力口 ( Kageyama T. et al.， Journal of Clinical Microbiology, 41， 1548-1557 ( 2003 )),寸旦在该方法中， 存在引物二聚体等非特异扩增产物也被检测出的问题。进而， PCR需要急剧升降反应温度，这成为自动化时反应装置节省劳 动力和低成本化的障碍。另一方面，作为在一定温度下仅扩增RNA的方法，报告有 NASBA法(日本专利2650159号公报和日本专利3152927号公 报)、和TMA法(日本专利3241717号公才艮)等。该RNA扩增方 法中，通过包含针对目标RNA的启动子序列的引物、逆转录酶 及根据需要的核糖核酸酶H (RNase H)，合成包含启动子序列 的双链DNA,并通过RNA聚合酶合成包含目标RNA的特定;咸基 序列的RNA，该RNA继续作为包含启动子序列的双链DNA合成 的模板而进行链式反应。并且，在RNA扩增后，通过电泳或者 使用结合有能够检测的标记的核酸探针通过杂交法等来检测被 扩增的RNA。以上那样，所述RNA扩增方法由于在一定温度下通过一个 阶段仅扩增RNA,因此适于简便的RNA测定，但利用杂交法等 的检测需要繁杂的操作，存在无法重现性好地进行定量的问题。作为简便地扩增及测定RNA的方法，可以列举出Ishiguro等(曰本净争开2000-14400号^^才艮禾口Ishiguro T. et al.， Analytical Biochemistry, 314， 77-86 ( 2003 ))的方法。该方法中，在核酸 探针的存在下，实施所述RNA扩增方法，并测定荧光特性的变 化，所述核酸探针是用嵌入剂性荧光染料标记的核酸探针，且 按照以下方式i殳计而成当其与把核酸形成互补的双链时，则 嵌入剂性荧光染料部分嵌入所述互补的双链部分中，从而荧光 特性发生变化；该方法可以简便地、在一定温度下、通过一个 阶段且在密封容器内同时实施RNA扩增和测定。所述各核酸扩增方法均是通过由正义引物(第一引物)和 反义引物(第二引物)组成的引物对来扩增靶RNA的方法，众 所周知构成该引物对的引物序列的组合^f于所述核酸扩增的刻 率和特异性具有重要的意义。但是，由于诺如病毒具有极其多样的基因型，因此极其难以构建同样且高效率地扩增全部基因 型的引物对。
技术实现思路
根据基因序列的差异，诺如病毒大致分为基因组 (genogroup) I ( GI)和基因组II ( GII)这2种基因组。进而关 于各基因组，目前GI分为14种基因型，GII分为17种基因型(参 照感染症发生动向调查周报，6 ( 11 ), 14-19 ( 2004 ))。属于 GI的基因型间、属于GII的基因型间的碱基序列的同源性各约为 70%。此外，GI和GII的碱基序列的同源性为40 50%。为了使用所述基因扩增法通过诺如病毒检测试剂获得高的 检测率，作为引物结合区域，各种基因型间碱基序列高度保守 的20个石咸基以上的区i或至少需要2处。然而，作为GenBank上的 诺如病毒的序列，即使仅对以下6个序列 (Chiba (No.AB042808 ) 、 Norwalk ( No.M87661 ) 、 Southampton6(No丄07418 ) 、Camberwell ( No.AF145896 ) 、 Hawaii (No.U07611 )、 HuCV ( No.AY032605 ))的同源性进行调查， 基因型间石威基序列相同的20个石威基以上的区域也是不存在的。在这样的背景下，本专利技术人等已经提供了在GI、或者GII 的广泛基因型中具有较高检测率的检测方法(日本特开 2005-245434号公报)。但是，即使根据该方法，也不能说对诺 如病毒的全部基因型达到了高灵敏度且同样的检测，期望以更 高灵敏度检测更宽范围的基因型的诺如病毒RNA的检测方法。本专利技术人为了解决所述问题进行了深入研究，结果能够以 高灵敏度且简便、迅速地对诺如病毒RNA的宽范围的基因型进 行测定。第l方案为4全测试样中的诺如病毒RNA的方法，其特征在 于，其包括以下工序(1) 以诺如病毒RNA内的特定核酸序列为模板，通过第 一引物和第二引物、RNA依赖性DNA聚合酶、核糖核酸酶H(RNaseH)、及DNA依赖性DNA聚合酶，生成包含启动子序列 和在该启动子序列下游的所述特定^咸基序列的双《连DNA的工 序，其中，在所述第^引物和所述第二引物的任意一者的5，末 端附加有启动子序列；(2) 以该双链DNA作为模板，通过RNA聚合酶，生成包 含所述特定碱基序列的RN A转录产物的工序；(3 )该RNA转录产物继续作为所述双链DNA合成的模板， 从而将该RN A转录产物《连式扩增的工序；(4)测定所述RNA转录产物量的工序； 所述第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸 的混合物组成序列与序列号l ~ 4中记载的序列中的至少任意 一者分别充分相同的寡核苷酸；所述第二引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成序列与序列号5 ~ 9中记载的序列中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诺如病毒ＲＮＡ的检测方法，其特征在于，其为检测试样中的诺如病毒ＲＮＡ的方法，包括以下工序：　（１）以诺如病毒ＲＮＡ内的特定核酸序列为模板，通过第一引物和第二引物、ＲＮＡ依赖性ＤＮＡ聚合酶、核糖核酸酶Ｈ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）、及ＤＮＡ依 赖性ＤＮＡ聚合酶，生成包含启动子序列和在该启动子序列下游的所述特定碱基序列的双链ＤＮＡ的工序，其中，在所述第一引物和所述第二引物的任意一者的５’末端附加有启动子序列；　（２）以该双链ＤＮＡ作为模板，通过ＲＮＡ聚合酶，生成包含所述特定碱 基序列的ＲＮＡ转录产物的工序；　（３）该ＲＮＡ转录产物继续作为所述双链ＤＮＡ合成的模板，从而将该ＲＮＡ转录产物链式扩增的工序；　（４）测定所述ＲＮＡ转录产物量的工序；　所述第一引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混 合物组成：序列与序列号１～４中记载的序列中的至少任意一者分别充分相同的寡核苷酸；所述第二引物由选自下述寡核苷酸中的至少二种寡核苷酸的混合物组成：序列与序列号５～９中记载的序列中的至少任意一者分别充分互补的寡核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：益田升佳，宇根蔵人，斋藤寿一，林俊典，
申请(专利权)人：东曹株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]