嗜冷耐热双功能果胶酶、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及酶工程领域，尤其涉及嗜冷耐热双功能果胶酶、制备方法及其应用，以嗜热菌Thermotoga maritima来源的耐热果胶酶为基本骨架，在保留其耐热结构域骨架的基础上，通过定点突变在活性位点周围构建柔性微环境，所述果胶酶在5‑85℃温度范围内保持酶活性，其中在10℃下保持最大活性的50%以上，在70℃下保持最大活性的80%以上，最适反应温度为40‑50℃，pH适应范围为4.0‑9.0，本发明专利技术的双功能果胶酶在5‑85℃的广泛温度范围内均保持较高活性，在10℃仍保持最大活性的50%以上，在70℃仍保持最大活性的80%以上，远优于现有的单功能酶，实现了在同一个酶分子中兼具嗜冷和耐热特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶工程领域，尤其涉及一种同时具有嗜冷和耐热特性的双功能果胶酶及其制备方法及其应用。更具体地，本专利技术通过蛋白质工程技术设计和构建了一种在5-85℃宽温域内保持高活性的果胶酶，可应用于食品加工、造纸、纺织以及生物能源等领域。

技术介绍

1、果胶酶是一类能够降解植物细胞壁中果胶物质的水解酶，在果汁澄清、果胶提取、纤维素脱胶以及生物质转化等工业过程中具有重要应用价值。根据催化机制的不同，果胶酶主要分为三类：多聚半乳糖醛酸酶（pg）、果胶酯酶（pme）和果胶裂解酶（pl），它们分别通过水解α-1,4糖苷键、催化果胶分子中甲酯键水解以及通过β－消除方式切断糖苷键。

2、现有技术中，根据温度适应性，果胶酶可分为嗜冷型、中温型和耐热型。嗜冷型果胶酶主要来源于生长在低温环境的微生物，如南极、深海等处的cladosporium属真菌和pseudoalteromonas haloplanktis等南极海洋细菌，其结构一般具有较高的柔性，特别是在活性位点周围区域，使其能在低温环境（5-30℃）下保持较高的催化活性。如已公开的专利技术专利us96506本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.嗜冷耐热双功能果胶酶，其特征在于：所述嗜耐双功能果胶酶是以嗜热菌Thermotoga maritima来源的耐热果胶酶为基本骨架，在保留其耐热结构域骨架的基础上，通过定点突变在活性位点周围构建柔性微环境，所述果胶酶在5-85℃温度范围内保持酶活性，其中在10℃下保持最大活性的50%以上，在70℃下保持最大活性的80%以上，最适反应温度为40-50℃，pH适应范围为4.0-9.0。

2.根据权利要求1所述的嗜冷耐热双功能果胶酶，其特征在于：所述果胶酶的活性位点周围的柔性微环境通过以下步骤构建：在耐热果胶酶的结构骨架上，选择性地将活性位点周围5.0埃范围内的特定氨基酸替换为甘...

【技术特征摘要】

1.嗜冷耐热双功能果胶酶，其特征在于：所述嗜耐双功能果胶酶是以嗜热菌thermotoga maritima来源的耐热果胶酶为基本骨架，在保留其耐热结构域骨架的基础上，通过定点突变在活性位点周围构建柔性微环境，所述果胶酶在5-85℃温度范围内保持酶活性，其中在10℃下保持最大活性的50%以上，在70℃下保持最大活性的80%以上，最适反应温度为40-50℃，ph适应范围为4.0-9.0。

2.根据权利要求1所述的嗜冷耐热双功能果胶酶，其特征在于：所述果胶酶的活性位点周围的柔性微环境通过以下步骤构建：在耐热果胶酶的结构骨架上，选择性地将活性位点周围5.0埃范围内的特定氨基酸替换为甘氨酸残基；所述特定氨基酸包括a95g、a133g、a201g和a267g的点突变。

3.根据权利要求1所述的嗜冷耐热双功能果胶酶，其特征在于：所述果胶酶通过将嗜冷菌pseudoalteromonas haloplanktis来源的果胶酶的五个柔性环区域序列整合到耐热果胶酶thermotoga maritima的相应位置，所述环区域为loop 6、loop 8、loop 15、loop 17和loop 33。

4.根据权利要求1所述的嗜冷耐热双功能果胶酶，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘睿颖，刘高峰，罗良丰，黄仲瑛，
申请(专利权)人：中山市南方新元食品生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：