用于细菌性脑膜炎的粘膜结合疫苗制造技术

一种用于粘膜给药的组合物，包含以下的两种或多种：（ａ）一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）的免疫应答；（ｂ）一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　　Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）的免疫应答；以及（ｃ）一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）的免疫应答。所述结合物可以通过单剂量免疫对抗三种不同原因导致的共同疾病，即细菌性脑膜炎。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本申请关于粘膜脑膜炎疫苗，特别是鼻内疫苗。
技术介绍
脑膜炎是组织的炎症反应，其可遍及脑部和脊髓。脑膜炎可以是细菌引起的或病毒引起的，细菌性脑膜炎通常更加严重。细菌性脑膜炎的主要的病原体为脑膜炎奈瑟氏球菌(NeisseriaMeningitidis)(脑膜炎球菌)，但是其他的相关病原体包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(Hib)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(GBS)。脑膜炎奈瑟氏球菌还能引起脑膜炎球菌败血病，这是感染引起生命危险的主要方面。防止Hib感染的疫苗已经存在很多年了。在1999-2000年，一种防止血清组C脑膜炎球菌(MenC)的疫苗被引进到一些欧洲国家。2000年，一种脑膜炎球菌疫苗在美国进入常规应用。对抗这三种病原体的疫苗是基于抗原荚膜多糖的，结合到被用于增强多糖免疫原性的载体蛋白。这些疫苗是通过注射给药的，虽然粘膜给药已经被描述用于小鼠，如参考文献1描述了Hib结合疫苗的鼻内给药，以及参考文献2描述了MenC结合疫苗的鼻内给药(也可参见参考文献3)。疫苗的粘膜给药提供了一种引人注目的方法，可克服对幼儿进行大量注射给药产生的问题。此外，由于多数病原体最初感染在粘膜表面，在感染位点引入粘膜免疫将有利于优化保护性免疫。基于囊状的疫苗的鼻内和口咽给药对抗血清组B脑膜炎球菌(‘MenB’)也已被人们所描述如参考文献4，如鼻内给药百日咳杆菌(B.pertussis)，其表达脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)铁传递蛋白结合蛋白B5。参考文献6描述了鼻内给药肺炎球菌结合疫苗也可参见参考文献7和8。本专利技术的目标是提供脑膜炎疫苗的粘膜给药的一些改进方案。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于粘膜给药的组合物，包含以下的两种或多种(a)一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的免疫应答；(b)一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)的免疫应答；以及(c)一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫应答。将不同抗原进行组合可减少不同药剂的给药数量而达到产生免疫作用、对抗多种病原体的效果。这可视为可注射疫苗的优点，使产生疼痛的注射次数减少，但这对于粘膜疫苗(如鼻内疫苗)来说不很重要，因为其在给药时具有较低的不舒适感。然而，即使对于粘膜给药，组合的抗原组合物也是有优点的，因为患者更愿意接受并且药物的运输/储藏方便。尽管将多种抗原复合成单一药剂是引入注目的如参考文献9-12，但仍然存在一些难点，不同组分一旦结合后会产生相互作用，尤其在液体制剂中13。出现的问题包括抗原干扰、抗原竞争14，15、抗原降解、抗原决定簇抑制、以及佐剂相容性。混合物的质量控制也更困难。此外，现有的关于组合抗原的认识集中在注射疫苗方面，而并非粘膜疫苗。尽管存在上述困难，本专利技术人出乎意料地发现，来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)和/或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原可以相互组合，用于粘膜给药，其不产生可预见的负面结果。来自这三种微生物的组合抗原也是有优点的，因为它能以单剂量对抗三种不同病因引起的共同疾病，即细菌性脑膜炎。该种类型的组合的脑膜炎疫苗以前曾经报导过16，但是未见关于粘膜给药的报导。粘膜给药本专利技术的组合物是用于粘膜给药的。在可用的多种粘膜给药途径中，鼻内途径是最实用的，因为这是容易实现的途径，只需相对简单并早已大量生产的设备即可。另外，鼻内免疫似乎更有效。因而，优选的粘膜给药途径是鼻内途径，并且本专利技术的组合物优选适于鼻内给药的方式，如鼻内喷雾、鼻内滴剂、凝胶或粉末如参考文献17和18。用于疫苗的粘膜给药的可选途径可以是口、胃、肺、肠、直肠、眼睛、以及阴道途径。(a)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)抗原组合物中流感嗜血杆菌抗原典型的是荚膜糖抗原。从流感嗜血杆菌获得的糖抗原是众所周知的。较优地，将Hib糖共价结合到载体蛋白以增强其免疫原性，尤其对于小孩。多糖结合物、特别是Hib荚膜多糖的制备已被大量报导如参考文献19-27等。本专利技术可应用任何合适的Hib结合物。所述结合物的糖结构域可以是一种多糖(如全长多聚核糖磷酸盐(PRP))，但优选水解多糖(如通过酸水解)来生成寡糖(如MW从约1至约5kDa)。如果进行水解，水解产物可根据大小分类，以去除对产生免疫原性来说太短的寡糖。经分离大小适当的寡糖是优选的糖抗原。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。这些是在结合疫苗中常用的。CRM197白喉类毒素是特别优选的28。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白29、合成肽30，31、热休克蛋白32，33、百日咳蛋白34，35、流感嗜血杆菌的蛋白D36、细胞因子37、淋巴因子37、激素37、生长因子37、艰难梭菌(C.Difficile)的毒素A或B38、铁吸收蛋白39等。也可应用载体蛋白的混合物。糖结构可以直接或通过一种连接物结合到载体蛋白。直接连接可通过多糖的氧化作用实现，同时伴随着蛋白上氨的还原，如参考文献40和41所描述的。连接基团的连接可以应用任何已知的方法，比如参考文献42和43所描述的。合适的连接物包括羰基、脂肪酸、B-氨基丙酸44、硝基苯基乙胺45、盐酰卤46、配糖键47、6-氨基己酸48、ADH49、C4至C12结构域50等。在结合前，糖通常被活化或功能化。活化作用可包括如氰化试剂，比如CDAP(如1-氰基-4-二甲氨基-吡啶硼酸四氟51，52。其他合适的技术应用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、p-硝基苯酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；还可参见参考文献53的介绍。还原氨化法是一种优选的技术。一种优选的结合包含通过脂肪酸琥珀二酯54，55将Hib糖共价地连接到CRM197上。本专利技术的组合物可包含多于一种的Hib抗原。(b)脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)抗原在组合物中脑膜炎奈瑟氏球菌抗原典型的是荚膜糖抗原(如来自血清组A，C，W135或Y)。来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原是已知的。然而，当抗原来自血清组B时，更优选所述抗原是蛋白抗原，这是因为天然的MenB荚膜多糖包含自身抗原。如果要应用来自血清组B的糖抗原，更优选应用经修饰的糖抗原如参考文献56，57，58，如经N-丙酰化作用修饰的抗原。来自其他血清组的糖的化学修饰也是可行的。所述糖优选寡糖，即荚膜多糖的片断。可将多糖进行处理来获得更短的寡糖，这可通过纯化和/或天然多糖分段来处理(如通过温和的酸水解、加热、分级色谱等)。优选的MenC寡糖公开在参考文献59和60中。所述糖优选可结合到前述载体蛋白的。本专利技术的组合物可包含多于一种的脑膜炎抗原。优选包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种(即2，3或4)的荚膜糖抗原61。当一种混合物包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于粘膜给药的组合物，包含以下抗原中的两种或多种：（ａ）一种抗原，其能诱导抗流感嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）的免疫应答；（ｂ）一种抗原，其能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　　Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）的免疫应答；以及（ｃ）一种抗原，其能诱导抗肺炎链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）的免疫应答。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DT欧哈根，
申请(专利权)人：启龙有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]