【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌检测，具体而言，涉及一种基因改造d29噬菌体及在mtb检测中的应用。
技术介绍
1、结核病是由mtb引起的最致命的传染病之一，mtb通过血行播散途径和淋巴道引流可引起腹部多器官和多部位结核，常规ct等检测方法针对该类型结核检测存在检测困难，开发快速可靠的mtb检测和鉴定方法对于器官结核的预防和治疗至关重要。
2、目前对结核分枝杆菌进行检测的非生物方法存在周期长、易漏检以及无法辨别细菌死活等问题。近年来，具有专一性强、繁殖迅速、精确度高等特点的噬菌体被开发用于mtb的生物检测，有望改善传统非生物法面临的困境。最早的的人工噬菌体是pearson等构建的荧光素酶报告噬菌体(lrps)，虽然其能特异性地侵染mtb，但仍存在结核菌荧光和背景荧光难区分且不能直接用于临床样品检测的问题。jain等在lrp的基础上，将荧光素酶替换成荧光蛋白gfp，与lrp相比，尽管gfp能在不需要任何反应底物条件下就能发出荧光，但是仍存在荧光信号容易被吸收、不能用于深层组织检测的问题，而近红外荧光蛋白(irfp)能够解决在深层组织中成像这一问题。filonov等借助irfp可清晰地观察活体的内部器官，而shcherbakova等将irfp670引入ncr鼠中，结合光声计算断层(pact)成像技术实现了肿瘤组织的多重成像。以上研究均证明了irfp具有很好的组织穿透性，但是仍存在荧光报告信号弱和侵染进去的噬菌体迅速地裂解掉宿主细胞导致检测窗口期短的问题。因此，提升现有噬菌体检测性能解决噬菌体检测mtb感染策略的荧光报告信号弱、检测“窗
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基因改造d29噬菌体，其能够延长噬菌体的存活时间，便于快速侵染宿主细胞，延缓噬菌体对于mtb的降解速度，延长报告荧光蛋白的检测窗口期。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种基于基因改造d29噬菌体在mtb检测中的应用，其能够提高mtb检测的灵敏度，可以用于感染部位侵染宿主，可以实现mtb原位检测，缩短检测时间，简化检测流程。
3、本专利技术的实施例通过以下技术方案实现：
4、一种基因改造d29噬菌体，采用pnz123构建系列用于同源重组的模板质粒，通过同源重组介导噬菌体基因组的无义突变与基因引入，获取噬菌体系列重组因子；其中，lysa在第25个氨基酸处无义突变，tgc突变为tga，lysb在第22个氨基酸处无义突变，tgg突变为tga，holin在第18个氨基酸处无义突变，tcg突变为tag，壳体蛋白前666bp长dna片段引入启动子l5，壳体蛋白后2000bp长dna片段引入p2a-irfp。
5、一种如上述的基因改造d29噬菌体在mtb检测中的应用。
6、本专利技术实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
7、本专利技术中，专利技术人拟采用合成生物学方法来改造噬菌体以提高其荧光强度和延长荧光检测“窗口期”。据查阅文献发现，温和噬菌体不能快速侵染细菌，所以对于结核菌侵染效果不佳。相对而言，具有高侵袭性的d29噬菌体因其能特异性地感染并裂解结核菌而被广泛地研究，现有研究表明，其对mtb的侵染和裂解能力极强，是本项目最合适的噬菌体之一。因此，本研究拟采用d29噬菌体作为底盘细胞进行合成生物学改造。
8、mtb能被快速检测的基础是噬菌体启动子启动荧光蛋白的高强度表达。启动子hsp60是结核杆菌噬菌体中研究最早和应用最广泛的启动子，mcnerney等通过hsp60启动子成功检测到了休眠期的结核菌，但存在荧光蛋白表达不充分，荧光信号弱的问题。因此需要探寻表达效率更高的启动子，启动子pl(l5)来源于分枝杆菌噬菌体l5基因结构的左臂上，具有促进蛋白高效率表达的特点，但噬菌体l5本身是温和型噬菌体，其侵染能力和裂解能力弱，难以用于结核菌的快速检测。基于此，专利技术人在前期实验中，尝试将启动子pl(l5)、pt7和phsp60导入d29噬菌体中表达荧光蛋白irfp，结果发现pl(l5)组的荧光强度约是phsp60组的8倍，是pt7组的6倍。因此启动子pl(l5)的加入有望解决d29中荧光蛋白表达效率低的问题。然而，荧光蛋白持续高表达则是延长窗口期的另一关键，即延长irfp荧光蛋白表达时间问题。
9、噬菌体通过多孔蛋白(holin)、肽聚糖水解酶(lysa)和分枝酰阿拉伯半乳糖酯酶(lysb)共同确保了宿主细胞的及时裂解。holin以质膜为目标，穿孔分枝杆菌细胞膜，从而使水解酶扩散到胞周质并导致细胞裂解，而lysa和lysb水解肽聚糖层并确保细胞裂解，其中lysa负责分解肽聚糖层中的肽聚糖和lysb负责分解胞外菌酸层。holin、lysa和lysb在细菌裂解过程中起着决定性的作用，当它们三者被单独抑制或者敲除的时候，能在一定程度上延缓细菌的裂解。通过对三个内溶酶基因同时敲除有望最大程度上延缓细胞的裂解。同时敲除内溶酶基因holin、lysa和lysb，还有望延长egfp荧光蛋白表达时间。
10、噬菌体是一类能感染细菌的特殊病毒，其不能感染比细菌更复杂的组织细胞，对人类不致病。关于噬菌体的安全测试已经在人类志愿者身上进行，经鉴定受试者并未出现任何不良反应。其给药方式为口服或直接应用在伤口、眼睛、耳朵或鼻子，经实践验证，不仅安全且疗效显著。以上研究表明，噬菌体对于人体是安全的和无伤害的。而在生物检测领域，经人工改造后的噬菌体被用于结核分枝杆菌、大肠杆菌以及金色葡萄球菌等病原菌的体外快速检测。因此，专利技术人将基于合成生物学改造后的人工噬菌体直接施用于感染部位，并通过光声计算断层成像技术(pact)实现对结核分枝杆菌细胞内近红外荧光蛋白。
11、通过分子生物学重组方法，在d29噬菌体基因组中引入启动子l5、近红外荧光蛋白irfp和自剪切多肽p2a，以增强irfp的表达，同时敲除内溶酶基因lysa以延缓噬菌体d29对于tmb的降解速度，从而延长报告荧光蛋白的检测窗口期。此外，还可以降低噬菌体分解溶菌酶的能力，延长噬菌体的存活时间。
12、将基因改造d29噬菌体用于检测mtb，通过向噬菌体中插入荧光或生物发光报告基因，可以在细菌感染后快速产生可检测的信号，提高检测的灵敏度和速度。此外，该噬菌体还可以直接用于侵染宿主细胞，能够长时间存活，从而长时间保持荧光的发光，便捷方便的实现mtb原位检测。该方法可在数小时内完成检测，比传统方法显著缩短了检测时间。通过改良样本处理和信号检测步骤，简化了操作流程，适合在资源有限的地区推广应用。
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1.一种基因改造D29噬菌体，其特征在于：采用pNZ123构建系列用于同源重组的模板质粒，通过同源重组介导噬菌体基因组的无义突变与基因引入，获取噬菌体系列重组因子；其中，LysA在第25个氨基酸处无义突变，TGC突变为TGA，lysB在第22个氨基酸处无义突变，TGG突变为TGA，Holin在第18个氨基酸处无义突变，TCG突变为TAG，壳体蛋白前666bp长DNA片段引入启动子L5，壳体蛋白后2000bp长DNA片段引入P2A-iRFP。
2.根据权利要求1所述的基因改造D29噬菌体，其特征在于：所述噬菌体DNA提取方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基因改造D29噬菌体，其特征在于：所述裂解缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述杂质沉淀液为氯仿，所述结合液为异丙醇，所述漂洗液为乙醇，所述洗脱缓冲液为TE缓冲液。
4.一种基于权利要求1-3任一项所述的基因改造D29噬菌体在MTB检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述MTB检测方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在步骤S1中，采用生理盐水进行冲洗，采用0.22μm的滤膜进行过滤。
...【技术特征摘要】
1.一种基因改造d29噬菌体，其特征在于：采用pnz123构建系列用于同源重组的模板质粒，通过同源重组介导噬菌体基因组的无义突变与基因引入，获取噬菌体系列重组因子；其中，lysa在第25个氨基酸处无义突变，tgc突变为tga，lysb在第22个氨基酸处无义突变，tgg突变为tga，holin在第18个氨基酸处无义突变，tcg突变为tag，壳体蛋白前666bp长dna片段引入启动子l5，壳体蛋白后2000bp长dna片段引入p2a-irfp。
2.根据权利要求1所述的基因改造d29噬菌体，其特征在于：所述噬菌体dna提取方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基因改造d29噬菌体，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁柯，罗阳，向德兵，
申请(专利权)人：重庆市江津区中心医院，
类型：发明
国别省市：
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