【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法。
技术介绍
1、d-氨基酸属于非天然蛋白质氨基酸，被广泛用于制作化妆品、抗生素、止痛药、减肥药以及抗癌等医疗用品上。目前基于d-氨基酸在细菌生理代谢中的作用，还有许多新的医疗用品在持续开发中。
2、半胱氨酸化学名为2-氨基-3-巯基丙酸，分子式为c3h2no2s，相对分子质量121.12。半胱氨酸属于脂肪族氨基酸，呈白色结晶性粉末，无臭、味酸、易被氧化，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、苯等有机试剂。根据构型不同，半胱氨酸分d型、l型和dl型，其中dl型为半胱氨酸的外消旋体。
3、d-半胱氨酸是合成第三代抗生素头孢米诺钠的重要中间体。头孢米诺钠对大肠杆菌、链球菌、克雷白杆菌、流感嗜血杆菌、拟杆菌等有很强抗菌作用，其对革兰阴性菌的作用较其它同类的药物更强。同时，d-半胱氨酸盐酸盐也是大肠杆菌的强抑制剂和急性酒精中毒的有效缓解剂。
4、目前，d-半胱氨酸的制备方法主要有诱导结晶法、化学拆分法、酶拆分法、不对称转化法。
5、(1)诱导结晶法
6、tadashi等人通过将浓氨水和dl-半胱氨酸盐酸盐混合获得dl-半胱氨酸，加入丙酮反应获得dl-2,2-二甲基四氢噻唑-4-羧酸，在40℃下使之形成过饱和溶液，加入d-2,2-二甲基四氢噻唑-4-羧酸作为晶种诱导结晶，过滤沉淀，水解产物获得d-半胱氨酸，收率为2％。该法相对于其它方法虽然简单，但是收率低，产物的光学纯度也达不到理想的要求。
7、(2
8、张涛等人将dl-半胱氨酸盐酸一水合物溶于水中，再将一定量的naoh和d-(-)-扁桃酸制成水溶液，升温搅拌，使d-(-)-扁桃酸完全溶解，与dl-半胱氨酸盐酸盐水溶液混合，将反应液置于冰浴中，待晶体大量析出时，过滤获得d-半胱氨酸-d-扁桃酸；向获得的d-半胱氨酸-d-扁桃酸中滴加稀盐酸溶液，升温完全溶解，冷却析出d-半胱氨酸盐酸盐，产品的比旋光-7.4°，单次反应回收率为25.6％。该方法根据其化学性质的不同实现分离，光学纯度也得以提高，但由于拆分过程中反应条件复杂，不利于环保和成本控制，在实际的工业生产中有一定的局限性。
9、(3)酶拆分法
10、酶拆分法具有反应条件温和、操作步骤简单、成本低廉等优点，因而引起了广泛的关注。
11、koito等人以s-苄基-dl-半胱氨酸盐酸盐的水溶液为底物，以一种从猪肝提取的酶为催化剂，在37℃下，反应4h，将底物中的s-苄基-l-半胱氨酸盐酸盐水解，保留s-苄基-d-半胱氨酸，将其分离后通过脱苄基反应，制得d-半胱氨酸。该方法反应过程繁琐、周期长，反应过程中要求底物浓度不能过高，反应效率低，最多只可能得到50％s-苄基-d-半胱氨酸。
12、(4)不对称转化法
13、shiariw等人将dl-半胱氨酸、r-酒石酸、丙酮和水杨醛置于乙酸中，在77℃下反应2.7h，然后置于冰浴中搅拌，经过过滤、洗涤、干燥，随后在60℃条件下于乙醇中搅拌1h，可获得d-半胱氨酸，光学纯度可达到100％，收率为80％。
14、以上制备d-半胱氨酸的方法都存在一些缺点和不足。诱导结晶法虽然操作简单，但其收率较低，仅为2％，且无法获得理想的光学纯度。化学拆分法中的反应条件复杂，需要大量的化学试剂，不利于环保和成本控制，并且单次反应回收率较低。酶拆分法虽然操作简单，但反应时间长，操作步骤繁琐，反应效率也较低。不对称转化法需要高温反应条件，消耗大量能源，且对设备要求较高。因此，开发一种高效、简便、低成本制备d-半胱氨酸的工艺势在必行。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法。
2、为了实现本专利技术的目的，本专利技术将采用如下技术方案加以实施。
3、一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以含12.0～17.2g/l的l-谷氨酸钠、5.4～8.0g/l的甘氨酸、14.2～20.6g/l的dl-半胱氨酸、1.3～1.8g/l的三磷酸腺苷和50～150g/l的六偏磷酸钠的缓冲液为反应体系，加入具有谷胱甘肽双功能合成酶突变体活性的基因工程菌细胞a或其粗酶液a和具有多聚磷酸激酶突变体活性的基因工程菌细胞b或其粗酶液b，在ph 7～9、30～45℃下反应，催化l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸生产谷胱甘肽，同时制得d-半胱氨酸。
4、作为本专利技术的优选方案，所述基因工程菌细胞a是以大肠杆菌e.coli bl21(de3)为宿主，质粒pet-28a为表达载体，携带谷胱甘肽双功能合成酶突变体基因形成的。
5、作为本专利技术的优选方案，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体基因能够编码谷胱甘肽双功能合成酶突变体。
6、作为本专利技术的优选方案，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体是由氨基酸序列seqid no.1所示的谷胱甘肽双功能合成酶中的一个或多个氨基酸残基位点发生突变形成的，其中，所述发生突变的氨基酸残基位点包括第17位的异亮氨酸突变为组氨酸、第48位丙氨酸突变为半胱氨酸、第94位苏氨酸突变为异亮氨酸、第123位精氨酸突变为苯丙氨酸以及第137位亮氨酸突变为丝氨酸。
7、作为本专利技术的优选方案，所述基因工程菌细胞b是以大肠杆菌e.coli bl21(de3)为宿主，质粒pet-28a为表达载体，携带多聚磷酸激酶突变体基因形成的。
8、作为本专利技术的优选方案，所述多聚磷酸激酶突变体基因能够编码多聚磷酸激酶突变体。
9、作为本专利技术的优选方案，所述多聚磷酸激酶突变体是由氨基酸序列seq id no.3所示的多聚磷酸激酶中的一个或多个氨基酸残基位点发生突变形成的，其中，所述发生突变的氨基酸残基位点包括第27位的谷氨酸突变为亮氨酸、第38位缬氨酸突变为丝氨酸、第101位异亮氨酸突变为苏氨酸、第122位甘氨酸突变为苯丙氨酸以及第237位亮氨酸突变为丙氨酸。
10、作为本专利技术的优选方案，所述粗酶液a是将所述基因工程菌细胞a的全细胞进行超声或高压匀浆破碎获得的。
11、作为本专利技术的优选方案，所述粗酶液b是将所述基因工程菌细胞b的全细胞进行超声或高压匀浆破碎获得的。
12、作为本专利技术的优选方案，催化反应的底物为dl-半胱氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、六偏磷酸钠、atp和镁离子。
13、作为本专利技术的优选方案，催化反应的底物dl-半胱氨酸可由化学法合成或消旋反应制得，也可由生物法制得，还可来源于dl-半胱氨酸或其盐酸盐的粗品。
14、谷胱甘肽双功能合成酶突变体和多聚磷酸激酶突变体或表达谷胱甘肽双功能合成酶突变体和多聚磷酸激酶突变体的基因工程菌在制备谷胱甘肽中的应用。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是提供了一种高效、简便、低成本制备d-半胱氨酸的新方法。
16、(1)本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以含12.0～17.2g/L的L-谷氨酸钠、5.4～8.0g/L的甘氨酸、14.2～20.6g/L的DL-半胱氨酸、1.3～1.8g/L的三磷酸腺苷和50～150g/L的六偏磷酸钠的缓冲液为反应体系，加入具有谷胱甘肽双功能合成酶突变体活性的基因工程菌细胞A或其粗酶液A和具有多聚磷酸激酶突变体活性的基因工程菌细胞B或其粗酶液B，在pH 7～9、30～45℃下反应，催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸生产谷胱甘肽，同时制得D-半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌细胞A是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，质粒pET-28a为表达载体，携带谷胱甘肽双功能合成酶突变体基因形成的。
3.根据权利要求2所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体基因能够编码谷胱甘肽双功能合成酶突变体。
4.根据权利要求3所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方
5.根据权利要求1所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌细胞B是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，质粒pET-28a为表达载体，携带多聚磷酸激酶突变体基因形成的。
6.根据权利要求5所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突变体基因能够编码多聚磷酸激酶突变体。
7.根据权利要求6所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突变体是由氨基酸序列SEQ ID NO.3所示的多聚磷酸激酶中的一个或多个氨基酸残基位点发生突变形成的，其中，所述发生突变的氨基酸残基位点包括第27位的谷氨酸突变为亮氨酸、第38位缬氨酸突变为丝氨酸、第101位异亮氨酸突变为苏氨酸、第122位甘氨酸突变为苯丙氨酸以及第237位亮氨酸突变为丙氨酸。
8.根据权利要求1所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述粗酶液A是将所述基因工程菌细胞A的全细胞进行超声或高压匀浆破碎获得的。
9.根据权利要求1所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述粗酶液B是将所述基因工程菌细胞B的全细胞进行超声或高压匀浆破碎获得的。
10.谷胱甘肽双功能合成酶突变体和多聚磷酸激酶突变体或表达谷胱甘肽双功能合成酶突变体和多聚磷酸激酶突变体的基因工程菌在制备谷胱甘肽中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以含12.0～17.2g/l的l-谷氨酸钠、5.4～8.0g/l的甘氨酸、14.2～20.6g/l的dl-半胱氨酸、1.3～1.8g/l的三磷酸腺苷和50～150g/l的六偏磷酸钠的缓冲液为反应体系，加入具有谷胱甘肽双功能合成酶突变体活性的基因工程菌细胞a或其粗酶液a和具有多聚磷酸激酶突变体活性的基因工程菌细胞b或其粗酶液b，在ph 7～9、30～45℃下反应，催化l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸生产谷胱甘肽，同时制得d-半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌细胞a是以大肠杆菌e.coli bl21(de3)为宿主，质粒pet-28a为表达载体，携带谷胱甘肽双功能合成酶突变体基因形成的。
3.根据权利要求2所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体基因能够编码谷胱甘肽双功能合成酶突变体。
4.根据权利要求3所述的一种双酶偶联制备谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体是由氨基酸序列seq id no.1所示的谷胱甘肽双功能合成酶中的一个或多个氨基酸残基位点发生突变形成的，其中，所述发生突变的氨基酸残基位点包括第17位的异亮氨酸突变为组氨酸、第48位丙氨酸突变为半胱氨酸、第94位苏氨酸突变为异亮氨酸、第123位精氨酸突变为苯丙氨酸以及第...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦庆才，刘均忠，姚启龙，杨春旋，王忠长，
申请(专利权)人：南京华辉天成生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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