【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和酶工程，具体涉及一种具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶及应用。
技术介绍
1、乙偶姻是一种广泛应用于医药、化工、食品、化妆品等行业的平台化合物。乙偶姻的合成方法分为两种：化学合成法和生物合成法。目前市面上的乙偶姻以化学合成法为主，然而化学法存在反应条件苛刻，转化率低，副产物多以及环境不友好等问题。近年来，因生物法合成乙偶姻具有反应温和，原料来源广泛、转化率高等优势吸引了研究人员的关注。乙偶姻的生物合成法分为微生物发酵法和酶催化法，通过代谢工程构建高效工程菌结合建立高效发酵策略，微生物发酵法已实现了乙偶姻的高产，但因发酵原料和产物分离成本较高，当前在成本上仍距产业化有一定距离。而酶催化法(包括全细胞和纯酶催化)因采用2,3-丁二醇、丙酮酸和双乙酰为底物，在底物成本或转化率上尚不具备竞争优势。因此，开发廉价底物和高催化性能酶用于合成乙偶姻对于其产业化具有重要价值。
2、现有开发的一种以乙醛为底物合成乙偶姻的乙醛裂合酶(acetaldehyde lyase，als)，进一步通过对该酶的催化活性中心和底物通道关键残基进行半理性改造得到了具有较高催化效率和底物耐受性的突变体als-i28v/l482e，然而，该突变体在热稳定性和底物耐受性上仍无法满足工业化生产的要求。因此，如何进一步提高乙醛裂合酶的热稳定性和底物耐受性是亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶及应用，该
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶，其是将乙醛裂合酶als-i28v/l482e做以下突变：
3、突变位点为m133l；或
4、突变位点为a134k；或
5、突变位点为e500r；或
6、突变位点为r89y；或
7、突变位点为a148i；或
8、突变位点为a148v；或
9、突变位点为l182i；或
10、突变位点为l182m；或
11、迭代突变m2：e500r和r89y突变位点组合突变；或
12、迭代突变m4：a148i和v181s突变位点组合突变；或
13、迭代突变m5：e500r、r89y和s503i突变位点组合突变；或
14、迭代突变m6：a148i、v181s和l182m突变位点组合突变；或
15、迭代突变m9：a148i、v181s、l182m和h185r突变位点组合突变；或
16、迭代突变m10：a148i、v181s和h185r突变位点组合突变；或
17、迭代突变m11：e500r、r89y、s503i、a148i、v181s、l182m和h185r突变位点组合突变；或
18、迭代突变m12：a134k、a148i、v181s、l182m和h185r突变位点组合突变；或
19、迭代突变m13：e500r、r89y、s503i、a134k、a148i、v181s、l182m和h185r突变位点组合突变。
20、上述提供的具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶在催化乙醛制备乙偶姻方面的应用。
21、采用上述具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶催化乙醛制备乙偶姻的方法，包括以下步骤：
22、向乙醛中加入乙醛裂合酶以及缓冲液进行催化反应，制备乙偶姻。
23、进一步地，乙醛浓度为1-2.5m。
24、进一步地，乙醛和乙醛裂合酶的摩尔比为1:3-8×10-6。
25、进一步地，反应过程中温度为30-60℃，反应时间为1-4h。
26、进一步地，反应体系中还加入缓冲液，缓冲液的ph为6-8。
27、进一步地，反应体系中还包括辅酶，浓度为0.15-0.25mm；优选辅酶为tpp，浓度为0.2mm。
28、进一步地，反应体系中还包括金属离子，金属离子浓度为1.5-2.5mm；优选金属离子为mg2+，浓度为2mm。
29、本专利技术具有以下有益效果：
30、本专利技术以乙醛裂合酶的突变体als-i28v/l482e作为初始突变体m1，对上述的热点氨基酸残基进行饱和突变，经筛选与测序，共获得有益突变15个，分别为m133l、a134k、d193m、l182m、l182i、s183p、e500r、s503i、d39k、r89w、r89y、a148v、a148i、v181s、h185r。随后对这15个突变体进行纯化，以初始酶m1作为对照，测定各自酶学性质以及酶动力学参数。结果表明m133l、a134k和e500r突变体的最适反应温度达到45℃，较m1的最适反应温度30℃提高了15℃；e500r突变体的半衰期提升至18.3h，较m1的7.5h提高了2.44倍；a134k突变体的vmax值提升至26.95u/mg，较m1的5.40u/mg提高了4.99倍；e500r突变体的kcat/km值提升最高，达到了87.55s-1·m-1，较m1的23.33s-1·m-1提高了3.75倍。上述结果表明通过强化亚基界面可有效提升als酶的催化效率和热稳定性。
31、为了进一步提高酶突变体的性能，将上述有益突变体组合进行迭代突变构建多位点突变体。迭代突变按照三个界面独立进行，获得有益多点突变后再进行三个界面组合突变，最终确定最佳的多位点突变体。经多轮迭代突变后，最终获得一个热稳定性和耐受性提升的8位点迭代突变体m13，其突变位点分别为a148i、v181s、l182m、h185r、e500r、r89y、s503i、a134k，半衰期达到了36.3h，较m1提高了4.84倍；其vmax和kcat/km值达到了78.07u/mg和287.38s-1·m-1，较m1分别提高了8.7倍和12.3倍。在乙醛浓度为2.5m时，反应6h的转化率达到了82.34％，而m1在该浓度下转化率仅为8.00％。此外，在迭代突变过程中，获得了一个乙醛耐受度最高的迭代突变体m4，其在乙醛浓度为2.5m时，反应6h的转化率可达100％，但其热稳定性和催化效率低于m13。
32、为了对得到的乙醛裂合酶突变体进行工业性能方面的考察，对初始突变体m1、融合蛋白elp-m1、迭代突变体m4和迭代突变体m13进行分批补料反应，考察其在高浓度乙醛条件下乙偶姻的产量。分批补料条件下，初始突变体m1乙偶姻产量达到60.67g/l，融合蛋白elp-m1乙偶姻的产量达到95.75g/l，较初始突变体m1提高了57.8％，而迭代突变体m4和m13的乙偶姻产量分别达到158.02g/l和187.59g/l，为初始突变体m1的2.60倍和3.09倍。
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1.一种具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶，其特征在于，将乙醛裂合酶ALS-I28V/L482E做以下突变：
2.权利要求1所述的具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶在催化乙醛制备乙偶姻方面的应用。
3.采用权利要求1所述的具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶催化乙醛制备乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，乙醛浓度为1-2.5M。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，乙醛和乙醛裂合酶的摩尔比为1:3-8×10-6。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，催化反应过程中温度为30-60℃，反应时间为1-4h。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系中还加入缓冲液，缓冲液的pH为6-8。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括辅酶，浓度为0.15-0.25mM。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括金属离子，金属离子浓度为1.5-2.5mM。
【技术特征摘要】
1.一种具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶，其特征在于，将乙醛裂合酶als-i28v/l482e做以下突变：
2.权利要求1所述的具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶在催化乙醛制备乙偶姻方面的应用。
3.采用权利要求1所述的具有热稳定性和底物耐受性乙醛裂合酶催化乙醛制备乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，乙醛浓度为1-2.5m。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，乙醛和...
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