【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及去甲基化brd7启动子区cpg岛高甲基化区域进而活化抑癌基因brd7表达的lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas基因编辑系统及其制备方法，同时涉及该基因编辑系统在制备肿瘤治疗制剂中的应用。
技术介绍
1、肿瘤的发生是环境因素与遗传因素共同作用的结果，更多是经过多因素参与的多阶段病理过程，目前癌症的治疗进展远不如人意，临床治疗多以手术及放化疗为主，必要时也会结合靶向治疗、生物治疗等方法。基因治疗是一种理想的治疗方式，它是将有治疗作用的一段基因序列通过一定方式导入机体靶细胞，通过转基因高水平表达，从而获得治疗效应的一种生物医学技术手段，是生物治疗的重要组成部分。随着恶性肿瘤发病机制在基因水平的认识和阐明，以及分子克隆和基因转移技术的日趋完善和成熟，基因治疗作为一种治疗手段日益被临床接受并进行了大量的新药临床研究。
2、brd7基因是课题组前期通过cdna代表性差异分析、文库筛选等方法自主分离克隆的一个在鼻咽癌细胞中低表达的全长新基因，并被证实在鼻咽癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤中发挥重要的抑癌功能，与肿瘤临床进展和不良预后负相关。然而，brd7在鼻咽癌、乳腺癌等多肿瘤中表达下调的机制尚不完全清楚。研究表明表观遗传修饰对基因表达的调控发挥着重要的作用，dna甲基化和组蛋白修饰等表观修饰调节染色质结构，任何畸变都会改变染色体结构，导致基因表达异常和病理改变。dna甲基化通常发生在cpg岛上，并通过抑制转录因子与启动子的结合或招募甲基化-cpg结合蛋白与抑制
3、dna去甲基化之前一直被认为是一个被动的过程，但是tet家族蛋白的发现提供了一个主动去甲基化过程。tet蛋白都含有一个保守的双链β-螺旋(dsbh)结构域，一个富含半胱氨酸的结构域，以及辅助因子fe(ii)和2-氧葡萄糖酸酯(2-og)的结合位点，它们共同形成c端的核心催化区。结构研究表明，该核心催化区域优先结合cpg背景下的胞嘧啶，但不与周围的dna碱基相互作用，并且对侧翼dna序列没有特异性。tet1基因最早被发现和鉴定为与mll基因融合的伴侣基因，在2009年，发现它可发挥双加氧酶作用，能将5mc转化为5hmc，进一步转化为5-甲酰胞嘧啶和5-羧胞嘧啶来完成去甲基化，随后5-甲酰胞嘧啶和5-羧胞嘧啶被细胞dna修复机制去除，再生出未甲基化的胞嘧啶，实现甲基化状态的逆转，调控基因表达。先前的研究表明brd7受表观遗传和转录调控，因此，我们推断，肿瘤细胞中brd7表达的转录再激活是可行的。
4、近20年来，基因组编辑技术取得了长足的进步，crispr/cas9系统因其简单、适应性强，迅速成为最受欢迎的基因组编辑平台。crispr/cas9技术的进步也使核酸酶缺陷cas9(dcas9)的各种应用成为可能，它可以结合基因组的特定区域，不仅继承了crispr/cas9系统的精准性，同时还展现出了良好的作用效果。在该系统中dcas9蛋白保留了cas9蛋白结合dna的能力而切割功能不复存在。最近的研究表明，将dcas9蛋白与多种效应蛋白的催化结构域融合，产生crispr激活剂(crispra)或抑制物(crispri)，激活或沉默目标基因的表达，可连接如dna去甲基化酶tet1，转录激活因子vp64、转录抑制效应子krab等，可使基因去甲基化、激活或者失活，对基因表达与表观遗传修饰进行精确调控。因此以crispr/dcas9系统为框架的不同表观遗传修饰系统在人类疾病治疗和癌症研究领域具有重要的研究价值。但是目前被广泛使用的仍然是双质粒系统，虽然可进行靶向dna去甲基化，但是去甲基化作用是短暂的，在体内不能达到长期效果；而改编自张锋等人的crispr/cas9质粒的lenticrisprv1/dcas9质粒可以组成性表达sgrna，能够实现对目标基因的持续性干预，但是该质粒系统仍然存在病毒组装效率低、细胞感染能力弱等方面的不足；而市面上新研发的lenticrisprv2载体(addgene#52961)能产生较lenticrisprv1约10倍高滴度的病毒，在目标基因的递送和靶向识别等方面具有更明显的优势。因此，本专利技术中我们基于原有的lenticrisprv1/dcas9质粒和lenticrisprv2首次构建了lenticrisprv2/dcas9-tet1cd质粒，并将特异性靶向brd7启动子高甲基化修饰区域的sgrnas分别连接到该质粒系统，从而成功构建了特异性靶向brd7启动子高甲基化修饰区域的lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas基因编辑系统。因此，经改造后的lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas质粒可以组成性地表达sgrna与dcas9-tet1cd融合蛋白，从而实现对目标基因的靶向、持续去甲基化和转录激活作用。
5、本专利技术中我们证实brd7启动子区域存在cpg岛高甲基化，此外，用dna甲基转移酶的有效抑制剂地西他滨处理的肿瘤细胞系显示，brd7启动子的甲基化水平显著降低，同时可显著增加brd7的mrna和蛋白表达水平。这清楚地表明，brd7启动子处的dna甲基化是brd7表达下调的关键机制。因此，针对brd7启动子区域cpg岛的具体甲基化位点，我们改造了lenticrisprv2载体，构建了lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas基因编辑系统对brd7基因启动子区高甲基化区域进行靶向dna去甲基化编辑以及转录活化，结果表明，在sgrna2和sgrna5的牵引下，lenticrisprv2/dcas9-tet1cd系统在鼻咽癌和乳腺癌等多肿瘤细胞中均能促进brd7启动子区域的去甲基化，并促进brd7 mrna和蛋白的表达，从而证明了该系统的在多肿瘤中活化brd7表达的有效性和广谱性。体内外实验结果表明该基因编辑系统能够显著抑制鼻咽癌、乳腺癌等多肿瘤细胞的增殖和体内肿瘤的生长，从而表现出抗肿瘤效应。这些结果提示我们，基于lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas基因编辑系统的构建及肿瘤治疗制剂的制备可用于brd7低表达肿瘤患者的临床靶向治疗，可望成为肿瘤个体化治疗的一种重要分子策略。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的是提供lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas基因编辑系统的制备方法，主要应用到慢病毒递送和dcas9定向引导的去甲基化技术，并证实该系统能有效活化鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等肿瘤细胞中brd本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于抑瘤基因BRD7的LentiCRISPRv2/dCas9-TET1CD-sgRNAs基因编辑系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括：
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，
7.LentiCRISPRv2/dCas9-TET1CD-sgRNAs基因编辑系统，其特征在于，是由权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的。
8.权利要求7所述的LentiCRISPRv2/dCas9-TET1CD-sgRNAs基因编辑系统的应用，其特征在于，制备肿瘤治疗制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括：鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等BRD7在其中低表达的多种肿瘤类型。
10.权利要求7所述的LentiCRISPRv2/dC
...【技术特征摘要】
1.基于抑瘤基因brd7的lenticrisprv2/dcas9-tet1cd-sgrnas基因编辑系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括：
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，
7.lenticrisprv2/dcas9-tet1...
【专利技术属性】
技术研发人员：周鸣，魏建霞，李梦娜，薛长宁，陈峙朋，段玉梅，魏青青，郑乐媚，熊炜，曾朝阳，李桂源，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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