【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物检疫，具体为涉及一种新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂、试剂盒，及采用该试剂或试剂盒在检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒中的应用。
技术介绍
1、新德里番茄曲叶病毒(tomato leafcurl new delhi virus，tolcndv)是双生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)的病毒。其寄主范围很广，包括葫芦科、茄科、豆科等很多重要的蔬菜和花卉作物，已造成严重经济损失。tolcndv在近两三年中有很多国家发生报道，有进一步扩散蔓延趋势，欧盟、美国、英国、瑞士、阿根廷、摩洛哥等国家将其列入检疫性有害生物名录。经评估，该病毒进入、定殖和扩散的可能性大，经济影响大，检疫风险为高，通过种子种苗传入我国的风险较大，应采取措施进一步加强口岸检疫力度。我国对该病毒已采取相应的检疫措施。
2、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)是piepenburg等人在2006年利用参与细胞dna合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。该技术可以在37～42℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测。侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，lfd)是一种可视化观察扩增产物的端点检测技术，rpa扩增的双标记产物通过抗原抗体结合作用，在检测线位置形成“荧光素抗体-双标记
3、但，rpa-lfd存在技术瓶颈，其中最重要的技术瓶颈是引物和探针没有明确的设计原则，探针长度和探针相对于引物的最佳位置并没有固定的设计规则，研究者需要设计不同的引物和探针，增加该方法中引物和探针合成及筛选的成本，影响该方法的灵敏度和特异性。
4、在gene bank中报道的tolcndv基因序列非常丰富，仅tolcndv a组分全序列就有740多条，而且序列之间变异性很高，序列的全长只有2721个碱基。序列变异性越大设计能检测所有病毒株系的引物难度越高，因此，采用rpa-lfd检测新德里番茄曲叶病毒的难度较大，这也是目前尚未见任何报道rpa-lfd方法用于检测新德里番茄曲叶病毒的原因之一。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术提供一种新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，具有较高的特异性；为此，本专利技术还提供了新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂盒；另外，本专利技术还提供了检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的rpa-lfd方法，及采用上述试剂或试剂盒检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的一体化检测器和一体化检测方法。
2、本专利技术的第一方面，提供一种新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，包括上游引物、下游引物组成的特异性引物对和探针，其中上游引物选自seq id no:1所示的核苷酸序列，下游引物选自seq id no:2所示的核苷酸序列，探针选自seq id no:3所示的核苷酸序列。
3、作为优选的实施例，所述上游引物对应的序列为：
4、gtacagaatgtatagaagtcccgacgtgccaag
5、所述下游引物对应的序列为：
6、[5’-biotin]-cccagcacatagacggatttcacacagaatc
7、所述探针对应的序列为：
8、[5’fam]gcagtcctttgaatctaggcacgatgt
9、ctctc[thf]tattggcaaagtcatg[3’c3spacer]。
10、本专利技术的第二方面，提供一种新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂盒，该试剂盒包括上述的试剂。
11、本专利技术的第三方面，提供一种检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的rpa-lfd方法，包括如下步骤：
12、s1、从待测样品中提取总dna；
13、s2、以总dna为模板，加入特异性引物对和探针进行rpa-lfd反应，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物选自seq id no:1所示的核苷酸序列，下游引物选自seq id no:2所示的核苷酸序列，探针选自seq id no:3所示的核苷酸序列；
14、s3，将反应后的溶液加入试纸条，2-5min后观察试纸条的质控区和检测区；
15、若试纸条质控区出现一条红色检测线，检测区无检测线出现，则待测样品没有被新德里番茄曲叶病毒侵染；
16、若试纸条质控区出现一条红色检测线，检测区也出现一条红色检测线，则待测样品被新德里番茄曲叶病毒感染。
17、作为优选的实施例，所述上游引物和下游引物在rpa-lfd反应中的终浓度分别为0.4μm。
18、作为优选的实施例，所述探针在rpa-lfd反应中的终浓度为0.12μm。
19、作为优选的实施例，所述rpa-lfd反应的反应温度为37℃-39℃。
20、作为优选的实施例，所述rpa-lfd反应的反应时间为15-20min。
21、作为优选的实施例，所述s2中dna浓度为1.16fg/μl-11.6ng/μl。
22、本专利技术的第四方面，提供上述的试剂或试剂盒在检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒中的应用。
23、本专利技术的第五方面，提供一体化检测器，用于检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒，该一体化检测器包括上腔体和下腔体，所述上腔体上方设置有上盖体，下腔体下方设置有下盖体，所述上腔体内设置有试纸条，所述试纸条受上盖体作用进行上下移动，所述下腔体内放置有冻干混合体系，所述冻干混合体系包括由上游引物和下游引物组成的特异性引物对和探针，所述上游引物选自seq id no:1所示的核苷酸序列，下游引物选自seq id no:2所示的核苷酸序列，探针选自seq id no:3所示的核苷酸序列。
24、本专利技术的第六方面，提供一种一体化检测方法，利用上述的一体化检测器，包括如下步骤：
25、s1、从待测样品中获取样品提取液；
26、s2、向样品提取液中加入核酸释放剂，得到核酸粗提液；
27、s3、将核酸粗提液加入一体化检测器中，与冻干混合体系反应10-15分钟；
28、s4、通过上盖体向下移动试纸条，使其浸润反应体系，通过观察试纸条获得检测结果。
29、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
30、(1)本专利技术新德里番茄曲叶病毒rpa-lf本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新德里番茄曲叶病毒RPA-LFD可视化快速检测的试剂，其特征在于，包括上游引物、下游引物组成的特异性引物对和探针，其中上游引物选自SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，下游引物选自SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，探针选自SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的新德里番茄曲叶病毒RPA-LFD可视化快速检测的试剂，其特征在于，所述上游引物对应的序列为：
3.一种新德里番茄曲叶病毒RPA-LFD可视化快速检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的试剂。
4.一种检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物在RPA-LFD反应中的终浓度分别为0.4μM，所述探针在RPA-LFD反应中的终浓度为0.12μM。
6.根据权利要求4所述的检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述RP
7.根据权利要求4所述的检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的RPA-LFD方法，其特征在于，所述S2中DNA浓度为1.16fg/μL-11.6ng/μL。
8.权利要求1或2所述的试剂或权利要求3所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒中的应用。
9.一体化检测器，用于检测测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒，其特征在于，所述一体化检测器包括上腔体和下腔体，所述上腔体上方设置有上盖体，下腔体下方设置有下盖体，所述上腔体内设置有试纸条，所述试纸条受上盖体作用进行上下移动，所述下腔体内放置有冻干混合体系，所述冻干混合体系包括由上游引物和下游引物组成的特异性引物对和探针，所述上游引物选自SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，下游引物选自SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，探针选自SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
10.一种一体化检测方法，利用权利要求9所述的一体化检测器，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，其特征在于，包括上游引物、下游引物组成的特异性引物对和探针，其中上游引物选自seq id no:1所示的核苷酸序列，下游引物选自seq id no:2所示的核苷酸序列，探针选自seq id no:3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂，其特征在于，所述上游引物对应的序列为：
3.一种新德里番茄曲叶病毒rpa-lfd可视化快速检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的试剂。
4.一种检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的rpa-lfd方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的rpa-lfd方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物在rpa-lfd反应中的终浓度分别为0.4μm，所述探针在rpa-lfd反应中的终浓度为0.12μm。
6.根据权利要求4所述的检测待测样品中是否含有新德里番茄曲叶病毒的rpa-lfd方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：田沂民，于翠，于子翔，高军，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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