【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，更具体地，涉及一种猫豆胚性愈伤增殖的悬浮培养方法及其应用。
技术介绍
1、猫豆为豆科黎豆属植物，又名黎豆(藜豆)、狗爪豆、龙爪豆、虎豆、老鼠豆等，是生长在亚热带地区的一年生缠绕草质藤本植物，在广西、广东、贵州、云南、海南以及江西等地区均有种植。猫豆具有耐旱耐贫瘠、适应性强等特点，非常适宜于喀斯特石漠化地区种植。广西百色、河池等典型的喀斯特地貌地区均有种植猫豆。
2、猫豆富含左旋多巴(l-dopa)，豆粒中左旋多巴含量在6～9％，是生物体内一种重要的生物活性物质，是从l-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径中的重要中间产物，是临床上用于治疗老年人帕金森氏病所引起的震颤麻痹的特效药物。而猫豆种子则为目前提取左旋多巴的主要原材料，因猫豆为一年生植物，在生产上主要以收获种子进行保种并进行左旋多巴的提取，又由于猫豆产量有限等多方面问题难以满足目前市场需求。
3、关于猫豆通过细胞悬浮培养实现利用人工手段短期内实现生产增益的研究并不多，杭玲等(2001)对黎豆组织细胞培养发生植株再生进行了研究，获得了初期的胚性愈伤组织，但增殖较慢，无法用于产业化。而植物细胞悬浮培养具有生长快、环境和营养要求可控的优势，还可以开展次生代谢产物的开发和利用，实现大幅度增殖，是进行产业化的必经之路。但目前并未见有关如何建立高效稳定的猫豆胚性愈伤组织悬浮培养的报道。因此，能否提供一种猫豆胚性愈伤细胞增殖的悬浮培养方法是本领域技术人员急需解决的问题。
技术实现思路
1、本专
2、本专利技术的第二个目的在于提供所述一种猫豆胚性愈伤增殖的悬浮培养方法。
3、本专利技术的第三个目的在于提供所述悬浮培养方法培养得到的猫豆胚性愈伤悬浮细胞系。
4、本专利技术的第四个目的在于提供所述猫豆胚性愈伤悬浮细胞系的应用。
5、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
6、本专利技术首先提供一种猫豆胚性愈伤增殖的培养基组合，包括以下培养基：
7、培养基①：ms培养基加卡拉胶7.5～8.8g/l、蔗糖20～30g/l、vc 0.5～1.5mg/l；
8、培养基②：ms培养基加卡拉胶7.5～9.5g/l、蔗糖15～30g/l、6-ba0.5～1.5mg/l、naa0.05～0.5mg/l；
9、培养基③：ms培养基加卡拉胶7.5～10g/l、蔗糖10～35g/l、6-ba 1.0～3.0mg/l、naa 0.05～1.0mg/l、vc 0.5～1.0mg/l；
10、培养基④：1/2ms培养基加蔗糖10～15g/l、6-ba 3.0～4.5mg/l、naa 0.05～0.8mg/l、vc 0.5～2.0mg/l。
11、其中，所述1/2ms培养基为ms培养基配方中大量元素减半。
12、本专利技术所提供的猫豆胚性愈伤增殖的培养基组合，按照培养基①配方能建立起猫豆种子萌发体系，保持稳定的发芽率；按照培养基②配方对诱导猫豆胚性愈伤的培养起到重要作用，其他配方不能诱导出愈伤组织或诱导出的愈伤组织发白不呈现胚性状态；按照培养基③配方对保持胚性愈伤状态并进行增加愈伤增殖起到重要作用，添加vc在于提高其抗氧化能力；通过对培养基④中的基础培养基及所添加的激素进行筛选，得到以1/2ms培养基为基础培养基，培养的猫豆愈伤组织保持最佳状态的时间更长，活力更佳，而其它基础培养基均不能实现该效果。而将其中的naa替换为其它激素则会出现效果差，悬浮培养维持时间短且出现悬浮培养发褐发黑现象，不能保持细胞活性，体系建立不起来；因此，按照培养基④配方能够较好地建立起猫豆悬浮培养细胞系，得到组织状态良好的猫豆胚性愈伤悬浮细胞系。综上所述，本专利技术所提供的培养基组合适用于猫豆胚性愈伤细胞增殖的悬浮培养，可建立高效稳定的猫豆胚性愈伤组织悬浮培养。
13、进一步地，所述培养基④中naa的添加量为0.05～0.1mg/l。
14、优选地，所述猫豆胚性愈伤增殖的培养基组合，包括以下培养基：
15、培养基①：ms培养基加卡拉胶7.5g/l、蔗糖30g/l、vc 0.5mg/l；
16、培养基②：ms培养基加卡拉胶7.5g/l、蔗糖30g/l、6-ba 0.5mg/l、naa 0.05mg/l；
17、培养基③：ms培养基加卡拉胶7.5g/l、蔗糖30g/l、6-ba 3.0mg/l、naa 0.05mg/l、vc 0.5mg/l；
18、培养基④：1/2ms培养基加蔗糖15g/l、6-ba 3.0mg/l、naa 0.05mg/l、vc 0.5mg/l。
19、本专利技术还提供一种猫豆胚性愈伤增殖的悬浮培养方法，包括以下步骤：
20、s1.猫豆种子消毒：将种子冲洗、浸泡、消毒，去种皮处理后接种于上述所述培养基①中，诱导种子萌发至生长成为具有两对叶片的植株；
21、s2.猫豆胚性愈伤组织诱导：将s1所得植株的叶片进行创伤处理后接种于上述所述培养基②中培养，获得胚性愈伤；
22、s3.猫豆胚性愈伤悬浮培养初始材料的筛选：将s2所得胚性愈伤接种于上述所述培养基③中进行增殖培养，再进行3～4代愈伤继代筛选，获得胚性愈伤悬浮培养初始材料；
23、s4.猫豆胚性愈伤悬浮初级培养：将s3得到的胚性愈伤悬浮培养初始材料转接到上述所述培养基④中进行悬浮培养，筛选3～4代后获得胚性愈伤悬浮物；
24、s5.猫豆胚性愈伤细胞悬浮增殖培养：将s4得到的胚性愈伤悬浮物，沉淀处理，取沉积胚性组织加入上述所述培养基④进行悬浮培养，取培养后的沉积胚性组织接入上述所述培养基④中进行继代增殖悬浮震荡培养，获得猫豆胚性愈伤悬浮细胞系。
25、其中，本专利技术在猫豆胚性愈伤悬浮培养初始材料的筛选中，对不同愈伤继代进行了不同代系的胚性愈伤进行筛选，研究表明，过少或过多的愈伤继代得到的胚性愈伤组织作为初级悬浮培养材料，在后续培养中的愈伤组织状态不佳趋于死亡，或所得悬浮组织产生左旋多巴含量少和组织活性也较差，只有3～4代胚性愈伤在后续培养中组织状态好，其产生的左旋多巴含量较高且活性较佳。因此，本专利技术所提供的猫豆胚性愈伤增殖的悬浮培养方法可建立稳定的猫豆胚性愈伤悬浮细胞系，细胞系建立起来能够为细胞融合、转基因等分子研究以及次生代谢研究提供很大的原材料，通过次级代谢产物的研究能够为左旋多巴研究提供更多理论依据和参考。
26、进一步地，步骤s1中所述种子为采集收取成熟带有豆荚的猫豆荚，轻轻剥去豆荚，得到灰白色的种子。
27、进一步地，步骤s1中所述冲洗、浸泡、消毒为流水冲洗后洗洁精震荡处理，流水冲洗至无泡沫，75％酒精处理，无菌水冲洗，0.1％ hgcl溶液消毒8～10min，无菌水冲洗。
28、其中，所述步骤s1中若消毒时间不足或省略其中的消毒步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猫豆胚性愈伤增殖的培养基组合，其特征在于，包括以下培养基：
2.一种猫豆胚性愈伤增殖的悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤S1中所述冲洗、浸泡、消毒为流水冲洗后洗洁精震荡处理，流水冲洗至无泡沫，75％酒精处理，无菌水冲洗，0.1％HgCl溶液消毒8～10min，无菌水冲洗。
4.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤S2中所述培养为暗处理培养至叶片卷曲，再进行光照培养至形成愈伤获得胚性愈伤。
5.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤S3中所述胚性愈伤为具有松散、生长快、活力旺盛的胚性愈伤。
6.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤S3所述增殖培养在光照环境下，温度23～27℃培养。
7.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤S4、S5中所述悬浮培养条件为在光照环境下，转速120r/min、温度23～27℃震荡培养。
8.权利要求2～7任一所述悬浮培养方法培养得到的猫豆胚性愈伤悬浮细胞系。<...
【技术特征摘要】
1.一种猫豆胚性愈伤增殖的培养基组合，其特征在于，包括以下培养基：
2.一种猫豆胚性愈伤增殖的悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤s1中所述冲洗、浸泡、消毒为流水冲洗后洗洁精震荡处理，流水冲洗至无泡沫，75％酒精处理，无菌水冲洗，0.1％hgcl溶液消毒8～10min，无菌水冲洗。
4.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤s2中所述培养为暗处理培养至叶片卷曲，再进行光照培养至形成愈伤获得胚性愈伤。
5.根据权利要求2所述悬浮培养方法，其特征在于，步骤s3中所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王洁华，何蕴轩，赵锡蝶，宋文芹，
申请(专利权)人：津宁植化广州科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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