区分马传染性贫血中国弱毒疫苗株与美洲流行毒株的方法技术

本发明专利技术公开了一种区分马传染性贫血中国弱毒疫苗株与美洲流行毒株的方法，包括：（１）从感染了待检测毒株的马外周血白细胞中提取ＤＮＡ；（２）以该ＤＮＡ为模板，以Ｐ１／Ｐ３为引物进行第一轮ＰＣＲ扩增；（２）以Ｐ２／Ｐ３为引物进行第二轮ＰＣＲ扩增；（３）ＰＣＲ产物进行双酶切分析；如果酶切出了３４０ｂｐ，１９０ｂｐ和１５０ｂｐ片段，则该检测毒株为美洲流行毒株；如果仅切出了３４０ｂｐ片段，则该检测毒株为中国弱毒疫苗株。本发明专利技术方法可以对阿根廷代表毒株感染马和中国疫苗免疫马进行准确的区分，可以灵敏特异的检测感染马传贫病毒的马匹，能够鉴别到０．２ｎｇ细胞染色体ＤＮＡ中的病毒特异性ＤＮＡ片段，而且只用５－７小时就可以快速的进行区分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种区分弱毒疫苗株与强毒株的方法，尤其涉及一种区分马 传染性贫血中国弱毒疫苗株与美洲流行毒株的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
马传染性贫血病(equine infectious anemia ， EIA)是马传染性贫血 病毒(equine infectious anemia virus ， EIAV)弓l起的一禾中马属动物的烈 性传染病。该病的特征是病毒持续性感染、免疫病理反应以及临床反复发作， 呈现发热并伴有贫血、出血、黄疸、心肌衰弱、浮肿和消瘦等症状。大多数 感染马传染性贫血病毒的马经过急性期和慢性期之后，进入一个无症状隐性带毒的阶段，变为EIAV终生携带者(Hammond SA， Cook SJ， Lichtenstein DL， Issel CJ， Montelaro RC. Maturation of the cellular and humoral immune responses to persistent infection in horses by equine infectious anemia virus is a complex and lengthy process.J Virol. 1997 May;71(5):3840-52)， EIAV在马体内以低水平复 制，是危险的传染源，给养马业带来巨大的经济损失。因而建立一种能够对 马匹进行阶段性检测地方法十分重要。根据其临床症状、病理变化及血清学试验可对马传染性贫血病作出诊断。 琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)和酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测EIA病毒感染简便而准确的方法，是世界动物卫生组织指定试验。此外，还有免疫荧 光抗体试验、补体结合试验、中和试验等。1975年哈尔滨兽医研究所研制成 功了马传贫弱毒疫苗，通过该疫苗的推广应用并采取了 "养、检、隔、封、 消、处"等综合性防治措施，使我国的疫情逐步得到控制(沈荣显，马传染 性贫血病驴白细胞弱毒疫苗的研制与应用。国际马传染性贫血病免疫学术 讨论会文集，哈尔滨1983， 21-23)，预计在今后几年消灭马传贫。而国 外尤其美洲等国家的马传贫至今仍很严重，纷纷要求引进我国的马传贫疫苗， 因此，开发该疫苗将其推向国际市场，必将对世界养马业作出极大的贡献。 但由于受马传贫病毒强、弱毒不能鉴别技术条件的制约而使我国马传贫弱毒疫苗迟迟不能走出国门。目前常规的马传贫诊断方法是用琼脂扩散实验(AGID)或酶联免疫吸附试 验(EL工SA)的方法来检测马传贫的P26抗原的抗体(Coggins,L"Norcross.N.， Nusbaum,S.,. Diagnosis of equine infectious anemia by immunodiffusion test.Am丄Vet.Res. 1972,33,11-18.)，虽然这些方法已经比较成熟，但是却存在 着一定的缺陷。首先，这些方法都是检测马匹血清中的抗体，而不是特异的 检测其病毒的存在，只有在马体内产生了针对该病毒的免疫应答之后才能检 测到其特异性的抗体，这样感染初期的马匹，在病毒的免疫应答还没有建立之前，用此方法检测可能出现假阳性(Issel, C. J., Cook, R. F.， A review of techniques for the serologic diagnosis of equine infectious anemia. J. Vet. Diagn. Invest. 1993, 5, 137-141 )。 1996年，Langemeier等(Langemerier, JL., Cook, R. F.，Rushlow, K. E.， d a/. Detection of equine infectious anemia vrial RNA in plasma sampales from recently infected and long-term inappaemt carrier animals by PCR丄Clin. Microbiol. 1996, 34， 481-1487)建立了一种RT-PCR的方法从马 的血浆中检测病毒的gag基因，这种方法尽管与琼脂扩散试验相比，灵敏性 有很大的提高，但是Oaks等(Oaks, J. L. ,McGuire.T. C.，Ulibarri,C., " a/. Equine infectious anemia virus is found in tissue macrophages during subclinical infection. J. Virol. 1998. 72. 7263-7269 )发现在病马处于亚临床感染状态时，用这种方法 有时不能从血桨中检测到病毒的存在。而Issel发现马传贫病毒进入马体后， 能够保持一种持续性感染，马传贫病毒以前病毒地形式整合在白细胞基因组 中， 一直能够持续很多年(Issel, C丄，Adams， W.V.,Meek,L. ， " a/. Transmission of equine infectious anemia virus from horses without clinical signs of disease. J. Am. Vet. Med . Assoc.1982， 180, 272-275)。因此利用PCR的方法马传贫前病毒 DNA，对于防制马传贫有很重要的意义，可以避免马处于隐性感染期时的漏检。马传染性贫血病曾经对整个世界的养马业造成巨大的危害，我国研制成 功的马传贫弱毒疫苗成功的控制了我国的马传染性贫血病，而且有实验表明 该疫苗对美洲等国家的马传贫病马有很高的保护作用，但是由于缺乏一种能 够将马传染性贫血中国弱毒疫苗株感染与美洲流行毒株感染区分出来的方 法，阻碍了该弱毒疫苗株向美洲等国家的推广和应用
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够将马 传染性贫血中国弱毒疫苗株感染与美洲流行毒株感染区分出来的方法。 本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种，包括.. (1)从感染了待检测毒株的马外周血白细胞中提取DNA; (2)以所提取的DNA为模板，以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3为引物进行第一轮PCR扩增； (2)以第一轮PCR扩增的产物为模板，以SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3为引 物进行第二轮PCR扩增；(3)取第二轮PCR扩增得到的675bp片段用Kpnl和 Bspl2861进行双酶切分析;(4)如果酶切出了 340bp， 190bp和150bp三条片 段，则该检测毒株为美洲流行毒株；如果仅切出了 340bp的一条片段，则该 检测毒株为中国弱毒疫苗株。上述方法中，其中，所述的第一轮PCR扩增的反应体系优选为反应体 系为25ul，其中，2.5 Pi IOXPCR缓冲液、2-2. 5ulTaq聚合酶，引物SEQ ID NO:l和SEQ ID N0:3各0. 5 u 1/L， 200umol/L dNTP， 2ulDNA模板，余 量为双蒸水；PCR循环参数优选为95i:/5min预变性后，95°C/4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种区分马传染性贫血中国弱毒疫苗株与美洲流行毒株的方法，包括：　　（１）从感染了待检测毒株的马外周血白细胞中提取ＤＮＡ；（２）以所提取的ＤＮＡ为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３为引物进行第一轮ＰＣＲ扩增；（２）以第一轮ＰＣＲ扩增的产物为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３为引物进行第二轮ＰＣＲ扩增；（３）取第二轮ＰＣＲ扩增得到的ＰＣＲ产物用ＫｐｎＩ和Ｂｓｐ１２８６Ｉ进行双酶切分析；如果酶切出了３４０ｂｐ，１９０ｂｐ和１５０ｂｐ三条片段，则该检测毒株为美洲流行毒株；如果仅切出了３４０ｂｐ的一条片段，则该检测毒株为中国弱毒疫苗株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周建华，相文华，耿庆华，郭巍，姜成刚，赵立平，吕晓玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]