检测待测植物样本是否含有植原体第Ｖ组成员的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测待测植物样本是否含有植原体第Ｖ组成员的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术提供了特异性引物对和特异性探针。所述特异性引物对是序列表的序列１所示核苷酸和序列表的序列２所示核苷酸组成的引物对。所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列３所示。本发明专利技术提供的方法，是以提取待测植物样本的基因组ＤＮＡ作为模板，用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光ＰＣＲ检测，确定待测植物样本是否含有植原体第Ｖ组成员。本发明专利技术公开的特异性引物对和特异性探针，可快速、方便、高灵敏度检测出植物样品是否携带或含有植原体第Ｖ组成员。检测过程中无需核酸染料，因此还具有环保安全的优点。可应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法及其专用试齐U盒。
技术介绍
植原体(phytoplasma)，原称类菌原体(mycoplasma—like organism,ML0)，为单细 胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，它可引起多种病害。植原体属于细菌界(Bacteria)， 硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，非固醇菌原体目(Achol印lasmatales)， 非固醇菌原体科(Achol印lasmataceae)。在1992年的第九届国际菌原体系统大(International Organization forMycoplasmology, 10M) Jl, ■出 了用 Hi 本 (Phytoplasma)作为一个新的属名。在整个柔膜菌纲的分类鉴定中，16SrDNA是系统鉴定的 首选标记。之后，众多研究者陆续根据16SrDNA序列结果将植原体分为若干16S组。根据最 新分类研究，以植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析，将植原体分为28个组。其中， 植原体第V组成员包括枣疯病植原体、樱桃致死黄化植原体、重阳木丛枝植原体等。尤其对于枣树来讲，在我国栽培范围极广，以山东、河北、山西、陕西、甘肃、安徽、 浙江产量最多。在枣树病害中，枣疯病(Jujube Witches' Broom)发生普遍，并且由于其防 治难度大，具有毁灭性，全国每年因枣疯病致枣树死亡带来的损失达数亿元。因此急需一种 简便快速的检疫检测方法，来有效的检测植原体第V组病害，达到早期预防和控制的目的。PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术是一种20世纪八十年 代处发展起来的分子生物学技术，用于富集特定的DNA片段。它运用从温泉细菌中分离出 的DNA聚合酶(DNA Polymerase)，通过变性、复性(退火)和延伸等三步反应，模拟体内DNA 复制。能够将极微量的核酸在短时间内迅速扩增复制，获得大量的目的DNA片段。实时荧光PCR是在常规PCR体系中加入了一条Taqman探针。Taqman探针5’端标 记有荧光分子，3’端标有淬灭基团。在PCR扩增过程中，与模板DNA配对正确的Taqman探 针在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性作用下，将荧光分子切下，检测荧光信号。实时荧 光具有高灵敏度、快速的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法 及其专用试剂盒。本专利技术提供了用于检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的特异性引物 对和特异性探针。所述特异性引物对是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组 成的引物对。上游引物(F):5，-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3，；下游引物(R):5，-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3，；所述特异性探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。特异性探针(P):5，-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3，。 所述特异性引物对和/或所述特异性探针在制备检测待测植物样本是否含有植 原体第V组成员的试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述植原体第V组成员具体 可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。本专利技术还保护一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒，包括 所述特异性引物对和/或所述特异性探针。所述试剂盒具体可由所述特异性引物对和所述 特异性探针组成。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病植原体、樱桃致死性黄花植原体 或重阳木丛枝植原体。本专利技术还保护一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的方法，是提取 待测样本的基因组DNA作为模板，用所述特异性引物和所述特异性探针进行实时荧光PCR 检测，确定待测样本是否含有植原体第V组成员。所述植原体第V组成员具体可为枣疯病 植原体、樱桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。所述实时荧光PCR的PCR反应体系 中，反应起始时，序列表的序列1所示核苷酸的浓度具体可为0. 3mM,序列表的序列2所示核 苷酸的浓度具体可为0. 9mM，所述特异性探针的浓度具体可为0. 2mM ；所述实时荧光PCR的 参数具体可为50°C、2min ；95°C、5min ；95°C、15s，60°C、lmin，40 个循环。用所述特异性引物对和特异性探针对待测植物样品进行检测时，若结果有Ct值 读出并且阴性对照无Ct值，则可判断该样品携带有植原体第V组成员。本专利技术提供的方法具有以下优点1)检测结果准确性高在专利技术开发过程中，选取枣疯病植原体(植原体第V组)、 樱桃致死性黄花植原体(植原体第V组)，重阳木丛枝植原体(植原体第V组)，以及泡桐 丛枝植原体(植原体第I组)和杏褪绿卷叶植原体(植原体第X组)为对象，进行特异性 检测，结果表明本专利技术检测准确性高。2)稳定性及重现性高在用本专利技术检测时，因为本专利技术基于模板数检测，相比于 普通PCR，检测结果重复性好，稳定性高。3)检测方法安全应用本专利技术探针及引物检测时，无需进行凝聚、染色等步骤，减 少了试剂对人体的伤害，因此具有安全性。4)省时本专利技术基于实时荧光PCR技术，省去凝聚、染色等步骤，减少了检测时间。5)检测结果易于判断本专利技术基于实时荧光PCR技术，检测结果呈现为数字和图 形，排除了主观因素，易于判断分析。6)检测灵敏度高应用本专利技术检测，具有较高的灵敏度，能够满足实际检测检验 的需要。7)易于操作掌握其操作过程与普通PCR反应操作相似，因此易于操作。8)应用可应用于检疫、科研等领域，尤其是对高通量和高灵敏性有要求的领域。本专利技术公开的特异性引物对和特异性探针，可快速、方便、高灵敏度检测出植物样 品是否携带或含有植原体第V组成员。检测过程中无需核酸染料，因此还具有环保安全的 优点。可应用于植物检疫、植物保护、科研等领域。附图说明图1为实时荧光定量PCR特异性；1 枣疯病植原体DNA ；2 樱桃致死性黄花植原体 DNA ；3 重阳木丛枝植原体DNA ；4，5 无反应的泡桐丛枝植原体和杏褪绿卷叶植原体。图2为枣疯病植原体DNA梯度实时荧光PCR检测(图中标注为分子拷贝数)。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。枣疯植原体(枣疯病植原体)、泡桐丛枝植原体(泡桐丛枝病植原体)、重阳木丛 枝植原体(重阳木丛枝病植原体)、樱桃致死性黄花植原体(樱桃致死黄花病植原体)和 杏褪绿卷叶植原体(杏褪绿卷叶病植原体)均来自野外发病植物，并经过了测序验证，其中 枣疯植原体的核苷酸序列如GENBANK ACCESS IONNUMBER :FJ445390所示，泡桐丛枝植原体 的核苷酸序列如GENBANK ACCESS I ONNUMBER :FJ263621所示，重阳木丛枝植原体的核苷酸 序列如GENBANK ACCESS I ONNUMBER :EF432569所示，樱桃致死性黄花植原体的核苷酸序列 如GENBANK ACCESS I ONNU本文档来自技高网...

【技术保护点】
序列表的序列１所示核苷酸和序列表的序列２所示核苷酸组成的特异性引物对。

【技术特征摘要】
序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的特异性引物对。2.核苷酸序列如序列表的序列3所示的特异性探针。3.权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述特异性探针在制备检测待测植 物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述植原体第V组成员为枣疯病植原体、樱 桃致死性黄花植原体或重阳木丛枝植原体。5.一种检测待测植物样本是否含有植原体第V组成员的试剂盒，包括权利要求1所述 特异性引物对和/或权利要求2所述特异性探针。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由权利要求1所述特异性引 物对和权利要求2所述特异性探针组成。7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于所述植原体第V组成员为枣疯病植 原体、樱桃致死性黄花植原体或重...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新，朱水芳，侯立华，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]