【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于聚腺嘌呤球形核酸的荧光免疫吸附分析方法，属于分子生物学检测。
技术介绍
1、氯霉素(cap)是一种广谱抗生素，由于其良好的抗菌效果，在动物源性产品中经常被用来预防或治疗疾病。然而，抗生素在环境中的残留现象越来越严重，残留的抗生素经过食物链富集到人体内，对生命健康造成了严重的威胁，容易引起再生性贫血障碍、灰婴综合症、引发神经毒性和癌变等。许多国家及地区如美国、欧盟、英国、日本等都对氯霉素有严格的检测要求。常见的氯霉素检测方法包括微生物检测法、色谱分析法、电化学分析法和酶联免疫分析法等。其中，酶联免疫吸附分析方法由于高效快速、高通量和高度特异性的特点，被广泛用于日常检测。然而这种传统方法对检测条件、试剂和人工操作的要求很高，因此有必要开发一种更简单高效的抗生素检测方法。
2、球形核酸是一种表面高密度修饰dna的金纳米颗粒，具有独特的光电性质和高度可包容特性，已被用于生物医药领域检测各种生物标志物。此外，随着等温核酸技术的发展，各种核酸信号放大策略也逐渐应用于检测领域。但是，用于检测的原料成本高、制备难度高，尤其是金纳米颗粒的制备与核酸酶的应用，占据检测试剂的绝大部分成本。
3、一种基于核酸外切酶ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法(cn113355388a)公开了基于核酸外切酶ⅲ，以纳米金为载体，合成dna-抗体检测探针的氯霉素检测方法，使用巯基修饰的trigger dna制备纳米金颗粒aunp，使用核酸外切酶exoⅲ实现荧光。该方法使用巯基修饰dna需要使用复杂的实验技术，包括dn
4、因此，亟需开发一种试剂成本更低、制备方法更简单，同时维持高灵敏度的氯霉素检测方法。
技术实现思路
1、针对现有技术制备复杂、成本高的问题，本专利技术使用聚腺嘌呤修饰dna，该过程通常是一种自然发生的生物过程，无需额外的人工干预，将较于巯基修饰dna成本更低、且更简单易得。在此基础上，本专利技术基于聚腺嘌呤球形核酸检测探针将间接免疫竞争法与杂交链式反应(hcr)结合，使用成本更低的s1核酸酶激活荧光，可以为痕量抗生素检测提供一种具有更有效信号放大效果的先进策略。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种检测氯霉素含量的方法，所述方法包括如下过程：黑色微孔板包被氯霉素抗原，封闭；将待测样本和携带trigger dna的氯霉素检测探针加入到黑色微孔板中，孵育后洗涤并拍干；加入信号dna分子h1和信号dna分子h2反应；加入s1核酸酶反应后荧光检测；将检测得到的荧光值与氯霉素为含量0时的荧光值的差值带入标准曲线，计算得到氯霉素浓度；所述trigger dna的核苷酸序列为：
3、5’-aaaaaaaaaaagtctaggattcggcgtgggttaa-3’(seq id no.1)；所述信号dna分子h1(简称h1)的核苷酸序列为：
4、5’-ttaacccacgccgaatcctagactcaaagtgtcataggattcggcgtg-3’(seq id no.2)；所述信号dna分子h2(简称h2)的核苷酸序列为：
5、5’-agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaa/bhq1-idt/cctatgacac/fam-idt/ttg-3’。
6、在一种实施方式中，所述标准曲线为y(a.u.)＝400.246x(ng/l)+1060.339，其中y(a.u.)为检测得到的荧光值与氯霉素含量为0时荧光值的差值，x(ng/l)为氯霉素含量的对数值。
7、在一种实施方式中，所述信号dna分子h2的核苷酸序列如：5’-agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaatcctatgacactttg-3’(seq id no.3)所示，在第34位的胸腺嘧啶t修饰荧光淬灭基团bhq1；在第45位胸腺嘧啶t修饰荧光基团fam。修饰后的信号dna分子h2的核苷序列为
8、5’-agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaa/bhq1-idt/cctatgacac/fam-idt/ttg-3’。
9、在一种实施方式中，所述携带trigger dna的氯霉素检测探针的制备方法具体如下：
10、(1)合成金纳米颗粒aunp：将haucl4溶液加热至沸腾，加入柠檬酸三钠，保持沸腾直至得到橘红色溶液体系，冷却，得到金纳米颗粒分散液；
11、(2)调节金纳米颗粒分散液的ph，加入氯霉素单克隆抗体孵育，获得aunp-抗体分散液；
12、(3)将聚腺嘌呤修饰的trigger dna加入到aunp-抗体分散液中，混匀并冷冻，溶化后加入peg20000，获得aunp-dna-抗体分散液；
13、(4)在所得aunp-dna-抗体分散液中加入bsa进行孵育，孵育结束后，固液分离，得到探针。
14、在一种实施方式中，上述步骤(1)中，haucl4分散在水中配制成0.01％v/v haucl4溶液。
15、在一种实施方式中，上述步骤(1)中，柠檬酸三钠配制成1％wt的水溶液进行添加。
16、在一种实施方式中，上述步骤(1)中，1wt％的柠檬酸三钠溶液与0.01％v/vhaucl4溶液的体积比为2.5ml：100ml。
17、在一种实施方式中，上述步骤(1)中，混匀反应的时间为15～20min。
18、在一种实施方式中，上述步骤(1)中，所得金纳米颗粒的粒径为14nm，置于4℃避光保存。
19、在一种实施方式中，上述步骤(2)中，ph具体可调至8.5。
20、在一种实施方式中，上述步骤(2)中，孵育的时间为1h。
21、在一种实施方式中，每1ml金纳米颗粒分散液中加入18μg氯霉素单克隆抗体，制备成aunp-抗体分散液后再添加40nmol的trigger dna。
22、在一种实施方式中，上述步骤(3)中，冷冻反应包括：将聚腺嘌呤修饰的triggerdna与aunp-抗体混匀后，-20℃静置30min。
23、在一种实施方式中，上述步骤(3)中，peg20000制成30％的水溶液进行添加；添加至使溶液中peg 20000的终浓度为1％。
24、在一种实施方式中，上述步骤(4)中，bsa的浓度为0.1g/ml；添加至使溶液中bsa的终浓度为0.01g/ml。
25、在一种实施方式中，上述步骤(4)中，孵育的温度为室温，时间为40min。
26、在一种实施方式中，上述步骤(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测氯霉素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：黑色微孔板包被氯霉素抗原，封闭；将待测样本和携带Trigger DNA的氯霉素检测探针加入到黑色微孔板中，孵育后洗涤并拍干；加入信号DNA分子H1和信号DNA分子H2反应；加入S1核酸酶反应后荧光检测；将检测得到的荧光值与氯霉素为含量0时的荧光值的差值带入标准曲线，计算得到氯霉素浓度；所述Trigger DNA的核苷酸序列为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线为y(a.u.)＝400.246x(ng/L)+1060.339，其中y(a.u.)为检测得到的荧光值与氯霉素含量为0时荧光值的差值，x(ng/L)为氯霉素含量的对数值。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述携带Trigger DNA的氯霉素检测探针的制备方法具体如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黑色微孔板加入0.15～0.2μg的氯霉素包被抗原，37℃孵育2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，携带Trigger DNA的氯霉素检测探针经缓冲液稀释后加入黑
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号DNA分子H1、H2的添加浓度均为100～400nM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1核酸酶的总添加量为20～60U。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用489nm和519nm波长检测荧光强度信号。
9.一种检测氯霉素的探针，其特征在于，所述探针包含经聚腺嘌呤修饰的Trigger DNA和氯霉素抗体，所述Trigger DNA和氯霉素抗体连接在金纳米颗粒上；所述Trigger DNA的序列为：5’-AAAAAAAAAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA-3’。
10.一种氯霉素检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求9所述探针、信号DNA分子H1、信号DNA分子H2和S1核酸酶；所述Trigger DNA的核苷酸序列为：
...【技术特征摘要】
1.一种检测氯霉素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：黑色微孔板包被氯霉素抗原，封闭；将待测样本和携带trigger dna的氯霉素检测探针加入到黑色微孔板中，孵育后洗涤并拍干；加入信号dna分子h1和信号dna分子h2反应；加入s1核酸酶反应后荧光检测；将检测得到的荧光值与氯霉素为含量0时的荧光值的差值带入标准曲线，计算得到氯霉素浓度；所述trigger dna的核苷酸序列为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线为y(a.u.)＝400.246x(ng/l)+1060.339，其中y(a.u.)为检测得到的荧光值与氯霉素含量为0时荧光值的差值，x(ng/l)为氯霉素含量的对数值。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述携带trigger dna的氯霉素检测探针的制备方法具体如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黑色微孔板加入0.15～0.2μg的氯霉素包被抗原，37℃孵育2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，携带trigger dna的氯霉素检测探针经缓冲液稀...
【专利技术属性】
技术研发人员：常巧英，郭亚辉，沈维韦，袁少锋，于志龙，于航，成玉梁，谢云飞，姚卫蓉，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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