一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法及应用技术

一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明专利技术涉及将从肠杆菌９０４３Ｃ１２中分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化酒用酸性脲酶，该固定化酸性脲酶的最适温度为４０℃，最适ｐＨ为４，贮存半衰期为７１天；本发明专利技术还涉及这种固定化酒用酸性脲酶的应用，在黄酒中加入该固定化酒用酸性脲酶后尿素去除率能达到８０％左右，连续使用２１次后，尿素去除率可达５１．６％。本发明专利技术可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，且固定化酒用酸性脲酶可以重复利用，是目前较为理想的去除酒中尿素的方法。

【技术实现步骤摘要】

—种固定化酒用酸性脲酶的制备方法及应用，具体地说是将从肠杆菌9043(:12中分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化酒用酸性脲酶，属于酶制剂、酿酒添加剂

技术介绍
氨基甲酸乙酯(或称尿烷，简称EC) ，2005年被国际癌症研究机构(InternationalAgency for Research on Cancer, IARC)划入2B (对人有致癌嫌疑物质)组。其致癌机理通过对体内氨基甲酸乙酯的代谢途径的研究可知有3种途径第一超过90%的氨基甲酸乙酯可被分解为乙醇、氨和碳水化合物等(这种途径是无毒性的)；第二约0.5%的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化成DNA加聚物，造成DNA双链破坏，可导致癌变；第三种途径较为普遍，即约0. 1 %的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化为N-羟基-氨基甲酸乙酯，后者能够诱导Cu调控的DNA损伤，这种损伤多发生于胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的残基上。大多数认为第三种途径是氨基甲酸乙酯的主要致癌途径。 国内外对酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途径为尿素途径，我国黄酒及日本清酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是来源于酒中所含尿素与乙醇的反应H2NC0NH2+C2H50H — C2H50C0NH2+NH3 而酒中尿素的主要来源为由微生物代谢产生，即由精氨酸代谢产生的尿素和原辅材料和酿造过程的培养液成分中所含的尿素。 在研究了影响氨基甲酸乙酯形成的因素后发现，尿素浓度、乙醇浓度等是最主要的因素。各国学者们对降低酒中氨基甲酸乙酯的方法进行了深入的研究，通过去除或降低酒中的尿素含量，可以达到控制氨基甲酸乙酯含量的目的。 向酒中添加酒用酸性脲酶可以降低尿素含量，但游离酶在溶液中不稳定，容易变性和失活，反应后酶难以分离回收，无法重复使用，利用固定化酶可避免以上的不足，扩大了酶的使用范围和使用次数。将游离酶制成固定化酶，向酒中添加固定化酒用酸性脲酶不影响黄酒正常的生产工艺，在勾兑，澄清酒的过程中，添加固定化酒用酸性脲酶，就可以降低尿素含量，且固定化酒用酸性脲酶易于与酒分离，可以重复利用，减少酸性脲酶的用量。 我国是世界上年产酒量最大的国家，有着十分悠久的酿酒历史，不仅产量大，而且品种多，许多产品在国际上享有较高的声誉。我国的绍兴黄酒在日本及东南亚拥有广泛的市场，但在1987年，日本有关部门提出绍兴黄酒中氨基甲酸乙酯含量超标(大于100 yg/L)，近年来，又在绍兴黄酒出口贸易上遇到了氨基甲酸乙酯的问题，为了降低酒中氨基甲酸乙酯的含量，绍兴黄酒集团至今仍需从日本进口酒用酸性脲酶。因此，为了人民的身体健康，也为了能更多的出口创汇，研究和生产我国自己的酒用酸性脲酶已成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法，将从肠杆菌9043C12 中分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化 酒用酸性脲酶，该固定化酸性脲酶的最适温度为40°C ，最适pH为4，贮存半衰期为71天；本 专利技术还涉及这种固定化酒用酸性脲酶的应用，在黄酒中加入该固定化酒用酸性脲酶后尿素 去除率能达到80%左右，连续使用21次后，尿素去除率仍可达51.6%。本专利技术可以不改变 原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，且固定化酒用酸性脲酶可以重复利用，是目前较为 理想的去除酒中尿素的方法。 本专利技术的技术方案一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法，将从肠杆菌9043C12中 分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化酒 用酸性脲酶，其工艺为 A、游离酶提取 (1)菌种采用肠杆菌(Enterobacter sp. )9043C12 ;中国专利ZL200610096635. 1已公开。 (2)种子培养 种子培养基组成种子培养基以g/L计葡萄糖20，蛋白胨IO，牛肉膏IO，酵母膏 5， KH2P04 2， NaC15， NaAc 2，尿素5， pH7. 0 (用NaOH调pH); 培养条件接种量5%，35°。恒温静置培养16 18h ; (3)发酵培养 发酵培养基组成以g/L计葡萄糖20，蛋白胨IO，牛肉膏5，酵母膏5， KH2P04 2，NaCl 5， NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0. 05，六水硫酸镍0. 05， pH5. 5 (HC1调pH); 发酵液培养条件接种量6%，35°。恒温静置培养28 32h ; (4)收集菌体将发酵液8000r/min、4t:离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次，pH5. 5的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，每升发酵液离心后所得菌体复溶于pH5. 5的35mL柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中； (5)超声波破碎超声波功率300w，破碎时间10min，处理量35mL ;将破碎液于4°C 下13000r/min离心20min，收集上清液，即为游离酶酶液； B、固定化过程 (1)将海藻酸钠溶入游离酶酶液中，控制海藻酸钠的质量/体积浓度达2%，充分搅匀，4t:冷藏静置至无气泡； (2)用注射器将步骤(1)的含海藻酸钠的游离酶酶液逐滴滴入其5倍体积的溶有 质量/体积浓度0. 25%壳聚糖和5%氯化钙的溶液中，磁力搅拌3h，去离子水洗涤，去除游 离壳聚糖和氯化钙，沥干，得固定化小球； (3)将步骤(2)所得固定化小球置于体积浓度0. 1%戊二醛中，固定化小球质量/ 戊二醛体积控制为2g/mL，微波3min后，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2. 5h，去离子水洗涤， 去除游离戊二醛，沥干，冷藏备用，得固定化酒用酸性脲酶。 制备的固定化酒用酸性脲酶的应用该固定化酸性脲酶的最适温度为4(TC，最适 pH为4，贮存半衰期为71天； 在黄酒中加入该固定化酒用酸性脲酶后，加酶量固定化酶重量/黄酒体积为100g/L，在动态的条件下，温度35°C ，作用时间18h，去除酒样中80%的尿素，连续使用21次 后，尿素去除率达51.6%。 该固定化酒用酸性脲酶的性质最适温度、最适pH及贮存半衰期的确定 在25-85t:范围内，每隔5。C，分别测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，最适温度为40°C。 在不同pH条件下分别测定酶活，以最高酶活力为100X，计算相对酶活力，最适pH 为4。 将固定化酸性脲酶放于4t:冰箱内，每隔三天测定固定化酸性脲酶的酶活，贮存半 衰期为71天。 该固定化酒用酸性脲酶的应用 (1)在动态的条件下，温度35t:左右，加酶量100g/L(固定化酶重量/黄酒体积)， 作用时间18小时，去除酒样中80%左右的尿素。 (2)将50g固定化酸性脲酶置于柱子中，在恒流泵的带动下，80mL黄酒以0. 5mL/ min的速度流过柱子，黄酒在柱子中循环一次后测定其尿素浓度，计算尿素去除率，首次使 用尿素去除率为83. 4%，然后再加入80mL的黄酒重复试验，重复21次后尿素去除率为 51. 6%。 酶活测定方法 游离酶活测定方法采用靛酚蓝反应(Berthelot reaction)比色法。 酶活力定义在常压，37t:， pH5. 5条件下，每分钟分解底物产生1 P mol氨为一个酶活力单位。 固定化酶活测定方法 固定化酒用酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法，其特征为：将从肠杆菌９０４３Ｃ↓［１２］中分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化酒用酸性脲酶，其工艺为：　　Ａ、游离酶提取：　　（１）菌种：采用肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）９０４３Ｃ↓［１２］；　　（２）种子培养：　　种子培养基组成：种子培养基以ｇ／Ｌ计：葡萄糖２０，蛋白胨１０，牛肉膏１０，酵母膏５，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］　２，ＮａＣｌ　５，ＮａＡｃ　２，尿素５，ｐＨ７．０；　　培养条件：接种量５％，３５℃恒温静置培养１６～１８ｈ；　　（３）发酵培养：　　发酵培养基组成：以ｇ／Ｌ计：葡萄糖２０，蛋白胨１０，牛肉膏５，酵母膏５，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］２，ＮａＣｌ　５，ＮａＡｃ　２，尿素５，四水硫酸锰０．０５，六水硫酸镍０．０５，ｐＨ５．５；　　发酵液培养条件：接种量６％，３５℃恒温静置培养２８～３２ｈ；　　（４）收集菌体：将发酵液８０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次，ｐＨ５．５的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，每升发酵液离心后所得菌体复溶于ｐＨ５．５的３５ｍＬ柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液中；　　（５）超声波破碎：超声波功率３００ｗ，破碎时间１０ｍｉｎ，处理量３５ｍＬ；将破碎液于４℃下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液，即为游离酶酶液；　　Ｂ、固定化过程：　　（１）将海藻酸钠溶入游离酶酶液中，控制海藻酸钠的质量／体积浓度达２％，充分搅匀，４℃冷藏静置至无气泡；　　（２）用注射器将步骤（１）的含海藻酸钠的游离酶酶液逐滴滴入其５倍体积的溶有质量／体积浓度０．２５％壳聚糖和５％氯化钙的溶液中，磁力搅拌３ｈ，去离子水洗涤，去除游离壳聚糖和氯化钙，沥干，得固定化小球；　　（３）将步骤（２）所得固定化小球置于体积浓度０．１％戊二醛中，固定化小球质量／戊二醛体积控制为２ｇ／ｍＬ，微波３ｍｉｎ后，置于磁力搅拌器上磁力搅拌２．５ｈ，去离子水洗涤，去除游离戊二醛，沥干，冷藏备用，得固定化酒用酸性脲酶。...

【技术特征摘要】
一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法，其特征为将从肠杆菌9043C12中分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化酒用酸性脲酶，其工艺为A、游离酶提取(1)菌种采用肠杆菌(Enterobacter sp.)9043C12；(2)种子培养种子培养基组成种子培养基以g/L计葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，pH7.0；培养条件接种量5％，35℃恒温静置培养16～18h；(3)发酵培养发酵培养基组成以g/L计葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，pH5.5；发酵液培养条件接种量6％，35℃恒温静置培养28～32h；(4)收集菌体将发酵液8000r/min、4℃离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次，pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，每升发酵液离心后所得菌体复溶于pH5.5的35mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中；(5)超声波破碎超声波功率300w，破碎时间1...

【专利技术属性】
技术研发人员：田亚平，吴召慧，吕园园，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]