本发明专利技术属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及Ｃ１序列上用于ＲＮＡ干扰的靶点，以及针对这些靶点的以各种方式获得的ＳｉＲＮＡ用于制备治疗骨质疏松症的新药物。本发明专利技术通过慢病毒感染破骨细胞并表达ＳｈＲＮＡ及体外基因敲低后破骨细胞功能检测的方法筛选了Ｃ１基因上的ＲＮＡ干扰的靶点。针对该靶点的ＳｈＲＮＡ能够明显抑制Ｃ１蛋白质的表达，并能稳定抑制破骨细胞的细胞外酸化和骨吸收的能力，但不影响成熟破骨细胞丝状肌动蛋白环的形成。依据这个靶序列可以制备生物药品以治疗骨质疏松。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与生物医药
，涉及破骨细胞V-ATP酶质 子泵亚基ATP6vlcl (简称C1)序列上用于RNA干扰的干扰靶点，以及针对 这些靶点的以各种方式获得的小干扰RNA分子以及其在制备治疗骨质疏松症 的药物中的应用。
技术介绍
骨质疏松症是发病率高、死亡率高、保健费用消耗大的最常见的骨代谢疾 病。据估计，半数以上的妇女和大约三分之一的男性在其生存期内会发生骨质 疏松性骨折。骨折给人们的生活带来极大的痛苦，轻者使人们生活质量下降， 重者将导致瘫痪(如股骨骨折)并由此引发很多并发症甚至导致死亡。这些疾 病的产生与破骨细胞(Osteoclast)的过度活跃有关。破骨细胞与成骨细胞 (Osteoblast)是骨中的两类重要细胞，分别负责骨吸收与骨形成，两者之间的平 衡保证了成年动物及人类骨量的恒定；然而在破骨细胞的活性大于成骨细胞活 性的时候，破骨细胞对骨的吸收大于成骨细胞的骨形成作用，导致骨密度下降 最终出现骨质疏松，对于这些疾病的治疗必须抑制破骨细胞的活性。破骨细胞皱褶缘V-ATP酶负责破骨细胞的细胞外酸化过程，使骨去矿化 并为蛋白酶降解骨有机成份提供酸性微环境。专利技术人通过Micrroarray数据分 析首次发现C1在破骨细胞中高表达而不是C2，因此，C1是C亚基在破骨细 胞中的特异亚型，即C1是破骨细胞V-ATP酶具有的特异亚基。抑制破骨细胞 Cl的表达导致破骨细胞细胞外酸化和骨吸收功能下降。在多核破骨细胞中， 骨吸收发生在致密的缝合区(sealing zone)内，缝合区包围着浆膜异化的皱褶 缘。缝合区由含actin的黏附结构，即podosome所构成，这一结构处于高度动 态平衡中，podosome由小的丝状肌动蛋白(F-actin)柱为中心，外周围绕着 蛋白如粘着斑蛋白(vinculin)和桩蛋白(paxillin)所构成。从皱褶缘分泌的3质子和酶被封闭在缝合区内的吸收腔隙。但体外培养在玻璃或塑料表面的成熟破骨细胞，其podosome在细胞外周形成一条环形的带状结构。专利技术人发现抑 制破骨细胞C1的表达使破骨细胞不能形成规则的丝状肌动蛋白纤维环，即抑 制破骨细胞C1的表达会导致破骨细胞缝合区形成缺陷。因此，Cl可以作为药 物靶点特异抑制破骨细胞的活性。本专利技术设计和体外慢病毒表达Cl-ShRNA 用于抑制破骨细胞的骨吸收活性，以达到治疗骨质疏松等骨相关疾病的目的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl (简 称C1)的RNA干扰靶点，针对该靶点设计人工序列，并将该序列在表达载体 中进行表达获得小干扰RNA分子(SiRNA)，并构建重组慢病毒表达载体。因 此本专利技术的目的也在于提供针对Cl的小干扰RNA分子，包含该小干扰R N A分子的表达载体以及由其转化的慢病毒表达载体，此外，由表达载体表达产 生的、作为小干扰RNA分子前体的短发夹结构RNA分子(ShRNA)也包含在 本专利技术中。本专利技术的另一 目的在于提供Cl的R N A干扰耙点在制备治疗骨质疏松药 物中的应用。根据本专利技术的一方面，根据破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl的 mRNA序列体外合成抑制Cl基因表达的双链小干扰RNA (SiRNA)片段的 DNA序列，并克隆到短发夹结构RNA (ShRNA)的表达质粒上，表达并筛选 对破骨细胞吸收抑制作用较强的Cl-SiRNA ，确定RNA干扰靶点序列，SEQ ID NO. 1~3为针对C1的RNA干扰靶点序列，优选的RNA干扰靶点具有如 SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。SEQ ID NO. 4~5为针对干扰靶点序列1的 设计的用于表达SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO. 6 7是针对干扰靶点序列2 设计的用于表达SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO. 8 9是针对干扰靶点序列3 设计的用于表达SiRNA的DNA序列，每对序列均为互补序列。具体序列见 表1和表2.SiRNA分子为双链RNA分子， 一单链含有RNA靶点序 和在3'末端的 UU双核苷酸尾(如SEQ ID NO. IO所示)，另一单链为互补链，双核苷酸尾 UU同样位于3'末端。SiRNA进入细胞后直接干扰目标基因的表达。表1 Cl RNAi耙点序列<table>table see original document page 5</column></row><table>表2合成用于表达siRNA的DNA序列<table>table see original document page 5</column></row><table>本专利技术的RNA耙点序列SEQ ID NO.3为具有19nt长度，在形成SiRNA 分子后，3'端加上UU双核苷酸尾构成分别具有21bp的双链RNA而发挥功能。 本领域技术人员可以理解的是，增加或减少几个碱基的SiRNA序列在基因沉 默中可以具有同样的功能，例如21 23bp的SiRNA序列己被证明在其他基因 的沉默中具有同样功能(Nature 2001， (411):24, 494-98)。同样可以理解的是， 也可以设计更长的序列，通过在发挥功能时被剪切为短的RNA序列而发挥作 用。体外合成的抑制CI基因表达的基因序列克隆到表达载体后，表达 ShRNA， ShRNA含有干扰耙点序列、干扰耙点序列的反义序列、短发夹结构 序列(序列如SEQ ID NO. 11所示)。形成ShRNA序列的短发夹结构序列优选 采用九个碱基的loop环序列UUCAAGAGA，也可以用TTCG tetraloop (Leukemia Research 30 (2006) 1013—1017)。短发夹结构RNA，通过表达载 体表达产生，发挥功能时需要细胞内Dicer酶切成siRNA分子干扰基因的表 达，图1示出了通过合成序列克隆到表达载体，产生ShRNA，再加工成具有 功能的SiRNA的过程。根据本专利技术的另一方面，提供CI基因的RNA干扰靶点在制备骨质疏松 药物中的应用，慢病毒介导的小干扰RNA分子可抑制破骨细胞的骨吸收活性， 用于治疗骨质疏松等骨相关疾病。实现本专利技术目的的技术手段为第一，在体外合成表达抑制CI基因表达的双链SiRNA的DNA序列，并 克隆到ShRNA表达质粒上；1、 SiRNA设计采用Dharmacon siDESIGN center (http:〃www.dharmacon.com)设计针对CI mRNA的特异靶序列，选取特异性的耙序列3条，且靶序列与人的相应靶序 列80%—90%相似。2、 单链SiRNA合成和纯化 由Invitrogen公司合成纯化3、 双链SiRNA的制备和表达ShRNA克隆的构建两条互补的单链SiRNA经加热后退火处理形成双链SiRNA，并将双链 SiRNA克隆到表达ShRNA的质粒上。第二，用外源共表达Cl-Flag蛋白和Cl-ShRNA筛选有效的Cl-SiRNA。 第三，通过破骨细胞功能实验阐明Cl敲低后破骨细胞骨吸收能力缺陷的 机制。1. 破骨细胞细胞外酸化和骨吸收功能检测体外破骨细胞功能实验采用被本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种破骨细胞Ｖ－ＡＴＰ酶质子泵亚基ＡＴＰ６ｖ１ｃ１的ＲＮＡ干扰靶点，其特征在于其具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亦平，丰盛梅，
申请(专利权)人：浙江赛尔生物医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]
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