羟烷基淀粉与G-CSF的偶联物制造技术

本发明专利技术涉及羟烷基淀粉与粒细胞集落刺激因子蛋白质（Ｇ－ＣＳＦ）的偶联物，其中该偶联物由羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质通过共价键形成。本发明专利技术还涉及制备这种偶联物的方法，以及这种偶联物的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】羟烷基淀粉与G-CSF的偶联物
本专利技术涉及羟烷基淀粉与粒细胞集落刺激因子蛋白质(G-CSF)的偶联物，其中这些偶联物由羟烷基淀粉或羟烷基淀粉的衍生物与蛋白质通过共价键形成。本专利技术还涉及制备这些偶联物的方法，以及这些偶联物的用途。
技术介绍
通常已知当这些蛋白质与聚合分子偶联时，可改善蛋白质的稳定性并且对抗这些蛋白质的免疫应答降低。WO 94/28024揭示经聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性蛋白质具有低的免疫原性和抗原性，并且在血液循环中的寿命显著高于未偶联的蛋白质，即清除率降低。G-CSF是一种21kDa的糖蛋白，其利用两个链内二硫键稳定，并且包含单一O-连接的碳水化合物部分。成熟的G-CSF具有174个氨基酸。动物体中的G-CSF由骨髓基质细胞、巨噬细胞和成纤维细胞合成。其主要功能是作为嗜中性粒细胞及其前体细胞的生长和分化因子。然而，本领域也已知G-CSF可活化成熟的嗜中性粒细胞。此外，它还刺激多种其它造血祖细胞的生长/分化(与其它造血生长因子协同作用)，并且促进内皮细胞的增殖和迁移。临床上，G-CSF用于给药治疗嗜中性粒细胞水平的缺乏(例如由再生障碍性贫血、脊髓发育不良、AIDS或化疗引起的)。WO 02/09766特别公开了生物相容性蛋白质-聚合物化合物，它是由生物活性蛋白质与生物相容性聚合物衍生物偶联制成的。所使用的生物相容性聚合物是高度反应性分支聚合物，所得的偶-->联物在聚合物衍生物与蛋白质之间包含一个长接头。作为生物相容性聚合物，描述了通式(P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A的聚合物，其中P和Q为聚合残基，k可为1或0。P和Q提到的有聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、聚三亚甲基二醇(polytrimethyleneglycol)、聚乳酸及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨基甲酸酯、聚磷腈、聚(L-赖氨酸)、聚亚烷基氧化物、聚丙烯酰胺和水溶性聚合物，如葡聚糖或多糖。蛋白质中特别提到α-、β-和γ-干扰素、血液因子、细胞因子，如白介素、G-CSF、GM-CSF。WO 02/09766的实施例中仅公开了仅与干扰素和表皮生长因子和人类生长激素偶联的单-、二-和三-聚乙二醇衍生物。WO 94/01483公开了由无生物活性聚合物或聚合物衍生物与药学上纯的合成亲水性聚合物通过特定类型的化学键共价结合形成的生物相容性聚合物偶联物。其中公开的天然聚合物及其衍生物有多糖类如透明质酸、蛋白聚糖如硫酸软骨素A、B和C、几丁质、肝素、硫酸肝素、葡聚糖如环糊精、羟乙基纤维素、纤维素醚和淀粉、脂质如甘油三酯和磷脂。提到的合成聚合物有平均分子量约100至约100,000的聚乙烯及其衍生物。提到的与聚合物或聚合物衍生物连接的蛋白质有细胞因子和生长因子，包括干扰素、肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子、生长因子如成骨因子提取物、表皮生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、酸性成纤维细胞生长因子，等等。WO 94/01483的所有实施例中都使用聚乙二醇衍生物作为聚合物。WO 96/11953公开了N-末端化学修饰的蛋白质化合物及其制备方法。具体来说，其中描述了由水溶性聚合物与G-CSF的N末端偶联形成的G-CSF组合物。WO 96/11953中也公开了N-末端与水溶性聚合物偶联的组合干扰素。虽然WO 96/11953中列出许多种水聚合物(例如乙二醇与丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚-->糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁茂烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物或聚氧乙基化多元醇)，但WO 96/11953的实施例中仅描述了PEG基化的G-CSF或组合IFN组合物。US 6,555,660B2公开的多肽偶联物包含具有G-CSF活性的多肽，其氨基酸序列与人类G-CSF氨基酸序列的不同之处在于至少一个特异性引入的和/或去除的氨基酸残基，其中该偶联物包含连接非多肽部分的基团，并且还包含至少一个附接在多肽该连接基团上的非多肽部分。该非多肽部分可为聚合物，如聚乙二醇或寡糖。US 6,555,660 B2中明确说明PEG是目前最优选的聚合物分子，因为与多糖类如葡聚糖相比，其仅具有极少的可以进行交联的反应性基团。WO 97/30148涉及变应原性降低的多肽偶联物，其包含与两个或多个多肽分子偶联的聚合载体分子。这些偶联物优选地是个人护理用品市场上所使用组合物的一部份。该偶联物的制备方法包括：活化聚合载体分子，两个或多个多肽分子与活化的聚合载体分子反应，并阻断偶联物上残留的活性基团。WO 97/30148中列出多种聚合载体分子，包括如天然或合成均聚物的不同类别的化合物，如多元醇、聚胺、聚羧酸和包含至少两个不同连接基团的杂聚物。其给出的实例包括星形PEGs、分支PEGs、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚-D，L-氨基酸。其中还公开了葡聚糖，如羧甲基葡聚糖，纤维素，如羟乙基纤维素或羟丙基纤维素，壳聚糖的水解物，淀粉，如羟乙基淀粉或羟丙基淀粉，糖原、琼脂糖、瓜尔胶、菊糖、支链淀粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸，等等。至于多肽，其中仅明确公开了几种酶。Baldwin，J.E.等人，Tetrahedron，vol.27(1981)，pp.1723-1726-->中描述了葡聚糖与羟乙基淀粉的化学修饰，产生的醛取代的聚合物可与血红蛋白反应，产生可溶性的与聚合物结合的血红蛋白。其显示可与氧结合，但心脏灌注实验清楚地证实，该与聚合物结合的血红蛋白不适宜用作血液代用品。WO 99/49897描述了由多糖类如葡聚糖或羟乙基淀粉与血红蛋白的氨基反应形成的血红蛋白偶联物。使用经氧化反应打开糖环所产生的醛基作为多糖的官能团。公开了硼烷二甲胺作为优选使用的还原剂。此外，WO 99/49897仅限于血红蛋白。WO 03/074087涉及一种偶联蛋白质与淀粉衍生的修饰多糖的方法。蛋白质与多糖(羟烷基淀粉)之间的结合作用是共价连接，此共价连接是在羟烷基淀粉分子的末端醛基或该末端醛基经化学修饰后所得的官能团与蛋白质的官能团之间形成的。公开了氨基、硫基和羧基作为蛋白质的反应性基团，但未提及蛋白质的醛基。此外，虽然其中列出不同连接的多种可能性，包括不同官能团，理论上合适的不同接头分子和不同的化学方法，但是实施例只给出两种选择：第一，使用氧化的羟乙基淀粉，采用乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)活化作用，直接与蛋白质偶联，或采用未氧化的羟乙基淀粉，直接与蛋白质偶联形成希夫氏碱(Schiff’s base)，其接着还原成各自的胺。因此，WO 03/074087的实施例既未公开通过蛋白质的硫基或羧基偶联的单一偶联物，也未描述包含羟乙基淀粉、蛋白质和一种或多种接头分子的偶联物。此外，其实施例中也未使用G-CSF分子。因此，本专利技术的一个目的在于提供现有技术中未曾描述的羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，与G-CSF的偶联物。本专利技术的另一个目的是提供制备这些偶联物的方法。
技术实现思路
-->因此，本专利技术涉及一种制备包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物为羟烷基淀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物为羟烷基淀粉（ＨＡＳ）且蛋白质为粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），该方法包括聚合物或其衍生物的至少一个官能团Ａ与蛋白质的至少一个官能团Ｚ反应，由此形成共价连接，其中Ｚ选自氨基、硫醇基、醛基和酮基，且　　　　－其中，如果Ｚ为醛基或酮基，Ａ包含与Ｚ形成该连接的氨基，或　　　　－其中，如果Ｚ为氨基，Ａ选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，　　　　－－其中，如果Ａ为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括向聚合物中引入Ａ，以产生聚合物衍生物　　　　－－－由聚合物与至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，并且至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是进一步化学修饰可产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或　　　　－－－氧化该聚合物，形成至少一个，特别至少两个醛基，或　　　　－－其中，如果Ａ为反应性羧基，该方法还包括向聚合物中引入Ａ，产生聚合物衍生物　　　　－－－选择性氧化聚合物的还原端，并活化所产生的羧基，或　　　　－－－由聚合物的未氧化的还原端与碳酸二酯反应，或　　　　－其中，如果Ｚ为硫醇基，Ａ包含　　　　－－马来酰亚胺基或　　　　－－卤乙酰基　　　　与Ｚ形成所述连接。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2003-8-8 PCT/EP03/08829;EP 2003-8-8 PCT/EP03/081.一种制备包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物的方法，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)且蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，该方法包括聚合物或其衍生物的至少一个官能团A与蛋白质的至少一个官能团Z反应，由此形成共价连接，其中Z选自氨基、硫醇基、醛基和酮基，且-其中，如果Z为醛基或酮基，A包含与Z形成该连接的氨基，或-其中，如果Z为氨基，A选自反应性羧基和醛基、酮基或半缩醛基，--其中，如果A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括向聚合物中引入A，以产生聚合物衍生物---由聚合物与至少双官能化合物反应，其中一个官能团可与聚合物反应，并且至少另一个官能团为醛基、酮基或半缩醛基，或者是进一步化学修饰可产生醛基、酮基或半缩醛基的官能团，或---氧化该聚合物，形成至少一个，特别至少两个醛基，或--其中，如果A为反应性羧基，该方法还包括向聚合物中引入A，产生聚合物衍生物---选择性氧化聚合物的还原端，并活化所产生的羧基，或---由聚合物的未氧化的还原端与碳酸二酯反应，或-其中，如果Z为硫醇基，A包含--马来酰亚胺基或--卤乙酰基与Z形成所述连接。2.根据权利要求1的方法，其中所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。3.根据权利要求2的方法，其中所述羟乙基淀粉的分子量为2至200kD，优选4至130kD，更优选4至70kD。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中Z为醛基或酮基。-->5.根据权利要求4的方法，其中所述醛基或酮基位于蛋白质的碳水化合物侧链和/或蛋白质的N-末端基团。6.根据权利要求5的方法，其还包括氧化蛋白质的碳水化合物侧链和/或氧化蛋白质的N-末端基团，产生醛基或酮基。7.根据权利要求6的方法，其中所述氧化反应是采用酶法或用高碘酸盐进行的，需要时，其分别可在除去末端唾液酸之后进行。8.根据权利要求4至7中任一项的方法，其还包括在包含基团A的聚合物衍生物与包含基团Z的蛋白质反应之前，先由聚合物的未氧化的还原端与包含可与聚合物的未氧化还原端反应的官能团和基团A的至少双官能连接化合物反应。9.根据权利要求4至8中任一项的方法，其中A为氨基氧基或酰肼基。10.根据权利要求8或9的方法，其中所述至少双官能连接化合物为均双官能化合物。11.根据权利要求10的方法，其中所述均双官能化合物包含两个氨基氧基。12.根据权利要求11的方法，其中所述均双官能化合物为O-[2-(2-氨基氧-乙氧基)-乙基]羟胺。13.根据权利要求8至12中任一项的方法，其中所述聚合物与所述至少双官能连接化合物的反应在水性介质中进行。14.根据权利要求11至13中任一项的方法，其中所述聚合物与所述至少双官能连接化合物的反应产生肟连接和/或氧氨基连接。15.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中Z为氨基。16.根据权利要求15的方法，其还包括选择性氧化聚合物的还原端，并由氧化的聚合物与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在其氧化的还原端上反应，产生包含反应性羧基A的聚合物衍生物。17.根据权利要求15的方法，其还包括由还原端未氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应，产生反应性羧基A。18.根据权利要求17的方法，其中所述碳酸二酯为对称性二酯。-->19.根据权利要求17或18的方法，其中酯的醇成分选自：N-羟基琥珀酰亚胺、磺酸化N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和硝基或卤素取代的苯酚。20.根据权利要求19的方法，其中所述卤素取代的苯酚选自：硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氯苯酚和五氟苯酚。21.根据权利要求17至20中任一项的方法，其中还原端未氧化的聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应产生反应性酯基A的反应在无水非质子极性溶剂中进行。22.根据权利要求21的方法，其中所述溶剂为二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或其混合物。23.根据权利要求15的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括由聚合物与至少双官能化合物的官能团M反应，产生聚合物衍生物，该至少双官能化合物还包含至少另一个为醛基，酮基或半缩醛基A的官能团Q。24.根据权利要求23的方法，其中M包含氨基。25.根据权利要求23的方法，其中A为醛基、酮基或半缩醛基，该方法还包括由聚合物与至少双官能化合物的官能团M反应，产生聚合物衍生物，该至少双官能化合物还包含至少一个不是醛基、酮基或半缩醛基的其它官能团Q，该方法还包括由官能团Q与至少一种合适的化合物反应，产生包含醛基、酮基或半缩醛基A的聚合物衍生物。26.根据权利要求24的方法，其中M和Q包含氨基。27.根据权利要求25或26的方法，其中所述至少一种合适的化合物包含羧基和醛基、酮基或半缩醛基。28.根据权利要求27的方法，其中所述至少一种合适的化合物为甲酰基苯甲酸或4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)丁酸。29.根据权利要求25或26的方法，其中M包含氨基，且Q-->包含β-羟基氨基。30.根据权利要求29的方法，其中所述聚合物在其氧化的还原端与至少双官能化合物的官能团M反应。31.根据权利要求29的方法，其还包括氧化β-羟基氨基，产生醛基。32.根据权利要求31的方法，其中所述氧化反应使用高碘酸盐进行。33.根据权利要求15的方法，其中所述聚合物使用高碘酸盐进行开环氧化反应，产生具有至少一个，特别至少两个醛基A的聚合物衍生物。34.根据权利要求23至33中任一项的方法，其中所述聚合物或聚合物衍生物与蛋白质的反应为还原性胺化。35.根据权利要求34的方法，其中还原性胺化在NaCNBH3的存在下进行。36.根据权利要求34或35的方法，其中还原性胺化在pH7或以下进行。37.根据权利要求36的方法，其中该pH为6或以下。38.根据权利要求34至37中任一项的方法，其中还原性胺化在0至25℃的温度下进行。39.根据权利要求34至38中任一项的方法，其中还原性胺化在水性介质中进行。40.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中Z为硫醇基。41.根据权利要求40的方法，其中A包含卤素乙酰基，该方法还包括由聚合物的任选氧化的还原端与具有至少两个各包含氨基的官能团的至少双官能化合物反应，产生具有至少一个包含氨基的官能团的聚合物衍生物，该方法还包括由聚合物衍生物与单卤素取代的乙酸和/或反应性单卤素取代的乙酸衍生物反应。-->42.根据权利要求41的方法，其中所述卤素为Br或I。43.根据权利要求41或42的方法，其中所述至少双官能化合物为具有2至10个碳原子的二氨基烷。44.根据权利要求41或42的方法，其中所述至少双官能化合物为具有1至5个亚烷基单位的二氨基聚乙二醇。45.根据权利要求41至44中任一项的方法，其中所述聚合物与所述至少双官能化合物在其氧化的还原端反应。46.根据权利要求41至45中任一项的方法，其中所述包含卤素乙酰基的聚合物衍生物与蛋白质在包含二甲基甲酰胺与水的混合物的溶剂存在下反应。47.根据权利要求40的方法，其中A包含马来酰亚胺基，该方法还包括聚合物在其任选氧化的还原端与包含可与该任选氧化的还原端反应的官能团U的至少双官能化合物反应，该至少双官能化合物还包含可经化学修饰产生马来酰亚胺基的官能团W，该方法还包括化学修饰官能团W，产生马来酰亚胺基。48.根据权利要求47的方法，其中U包含氨基。49.根据权利要求47或48的方法，其中W包含氨基。50.根据权利要求47至49中任一项的方法，其中包含W的聚合物衍生物与包含可与W反应的官能团并且还包含马来酰亚胺基的至少双官能化合物反应。51.根据权利要求50的方法，其中所述至少双官能化合物为N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯。52.一种根据权利要求1至51中任一项的方法制得的偶联物。53.根据权利要求52的偶联物，其中A为反应性羧基，且其中通过聚合物的至少一个羟基与碳酸二酯反应向还原端未氧化的聚合物中引入A，并且其中包含一个聚合物分子和通过酰胺键与该聚合物连接的至少一个，特别是1至10个蛋白质分子。-->54.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：和/或其中R1、R2和R3分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，其中G选自O和S，优选O，并且其中L为任选适当取代的直链、分支和/或环状烃残基，任选包含至少一个杂原子，优选具有2至60个碳原子的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基残基。55.根据权利要求54的偶联物，其中-L-为-(CH2)n-，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2、3、4、5、6，更优选2、3、4，特别优选4。56.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚-->合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：和/或其中R1、R2和R3分别独立为氢或具有2至10个碳原子的羟基烷基、羟基芳基、羟基芳烷基或羟基烷芳基，优选氢或羟基烷基，更优选氢或羟基乙基，且其中G选自O和S，优选O。57.一种包含蛋白质和聚合物或其衍生物的偶联物，其中该聚合物为羟烷基淀粉(HAS)，蛋白质为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其具有如下式的结构：...

【专利技术属性】
技术研发人员：沃尔弗拉姆艾希纳，赫尔穆特克内勒，卡塔琳娜卢特贝克，诺贝特灿德尔，罗纳德弗兰克，克劳斯佐默迈尔，哈拉尔德S康拉特，埃卡德格拉本霍斯特，
申请(专利权)人：弗雷泽纽斯卡比德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]